杜秀敏

（濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院，濟(jì)南 250031）

急性髓細(xì)胞白血病（AML）是多能干細(xì)胞或已經(jīng)輕度分化的前體細(xì)胞核型發(fā)生突變所形成的一類疾病。染色體核型異常，尤其是染色體易位是其典型的細(xì)胞遺傳學(xué)特征。染色體易位所涉及的AML分子改變一方面通過修飾生長因子受體的信號(hào)通路組分改變造血祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程;另一方面通過信號(hào)傳導(dǎo)分子的活化突變產(chǎn)生部分正常骨髓細(xì)胞分化所必需的轉(zhuǎn)錄因子活性與功能的改變。這兩類分子事件是互相依賴的，可能為臨床治療提供新的靶標(biāo)。本文結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)以上兩個(gè)方面作一綜述。

1 AML的細(xì)胞遺傳學(xué)特征

細(xì)胞遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，具有染色體異常的AML約占52%，其表現(xiàn)為平衡易位［如 t（8;21），t（15;17）和 inv16 AML］、不平衡易位（如 5q-，7q-，-5，-7和復(fù)雜核型AML）;而在無染色體核型異常中可存在明顯的分子異常，如FMS相關(guān)的酪氨酸激酶3（Flt3）、C/EBPα或干細(xì)胞因子受體（C-KIT）基因突變等［1］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞遺傳學(xué)亞型的改變與臨床預(yù)后高度相關(guān)。具有平衡易位的AML預(yù)后較好，患者可長期生存，其潛在治愈率為60% ～80%;具有非平衡易位的AML預(yù)后較差，僅10% ～15%可長期生存;無細(xì)胞遺傳學(xué)異常的AML預(yù)后介于前兩者之間，其長期存活率為25% ～30%［1］。

1.1 染色體平衡易位的AML 研究表明，平衡易位導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)失調(diào)是AML的主要發(fā)病原因。如在急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）中，PML基因與RAR-α基因融合，招募共抑制子結(jié)合到DNA鏈上，破壞DNA的轉(zhuǎn)錄。用全反式維甲酸處理可以逆轉(zhuǎn)這一過程，恢復(fù)維甲酸啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，使白血病細(xì)胞向粒系分化［2］。因而APL成為基礎(chǔ)研究推動(dòng)臨床治療的最顯著例子。另一平衡易位的AML是具有t（8;21）和inv16的AML。在具t（8;21）易位的AML中，產(chǎn)生AML1/ETO融合蛋白，導(dǎo)致粒系和粒單細(xì)胞系發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控子C/EBP-α和PU.1的失調(diào)［3］。這兩種轉(zhuǎn)錄因子的失調(diào)阻斷造血祖細(xì)胞的分化，繼而AML1/ETO通過JNK1/C-jun通路產(chǎn)生增殖激活［4］。

1.2 染色體不平衡易位的AML 目前，關(guān)于染色體不平衡易位的AML生物學(xué)特征知之甚少。對(duì)此類AML染色體核型改變的總體回顧發(fā)現(xiàn)，染色體全部或部分丟失占優(yōu)勢，尤其是5、7和17號(hào)染色體，而經(jīng)常增多的是8號(hào)染色體［5］。染色體平衡易位AML出現(xiàn)的頻率隨患者年齡的增加而增加，且分布于所有年齡組;而染色體不平衡易位的AML患者很少發(fā)生于40歲以下，且隨著患者年齡增加，其出現(xiàn)的頻率也急劇增加。表明染色體不平衡易位的AML可能發(fā)生于早期的多能造血干細(xì)胞，是以丟失部分基因?qū)е录?xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)及細(xì)胞凋亡的改變?yōu)樘卣鞯?而染色體平衡易位AML可能發(fā)生于發(fā)育得較為成熟的祖細(xì)胞期，伴隨著轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)失調(diào)，造成分化的阻斷。

2 AML的分子遺傳改變

關(guān)于轉(zhuǎn)錄和信號(hào)傳導(dǎo)在AML分子病理中的機(jī)制比較復(fù)雜，目前尚未完全明確。染色體平衡易位是其典型特征，它包含轉(zhuǎn)錄因子的改變及融合蛋白的形成。在AML發(fā)生過程中，祖細(xì)胞不僅丟失了分化能力，還逃脫了細(xì)胞增殖及存活的調(diào)控。

2.1 信號(hào)傳導(dǎo)的改變 AML是以非成熟的祖細(xì)胞克隆性生長為特征。細(xì)胞增殖加速、凋亡受抑制及分化受阻是這一病理事件的核心，而生長因子受體信號(hào)通路的改變在這一病理事件中具有關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，約50%初發(fā)AML患者骨髓細(xì)胞中可見信號(hào)傳導(dǎo)分子的改變及異常，最常見的是受體酪氨酸激酶（RTK）家族中 Flt3、N-Ras、K-Ras和 KIT的激活。這些突變的激活與轉(zhuǎn)換能力已在體外實(shí)驗(yàn)的骨髓細(xì)胞及小鼠細(xì)胞中得到證實(shí)，并與疾病的某些亞型相關(guān)。

2.1.1 AML中Flt3-ITD及其異常信號(hào)傳導(dǎo) Flt3是RTKs家族Ⅲ中的一員，與家族中其他分子（如血小板生長因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體及CKIT）高度同源。編碼 Flt3的基因位于染色體13q12，F(xiàn)lt3在早期的多能祖細(xì)胞中表達(dá)，而非原始干細(xì)胞。Flt3突變約見于30%的AML患者，且與不良預(yù)后有關(guān)［6］。研究表明，F(xiàn)lt3基因的回文序列和DNA修復(fù)機(jī)制的損傷可能導(dǎo)致了Flt-ITD（FLT3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)序列）突變的產(chǎn)生。Flt3-ITD可見于23%的AML患者，較少存在于AML的M2和M6亞型（FAB分型）中，而相對(duì)高表達(dá)于APL中。細(xì)胞遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lt3-ITD與正常核型高度相關(guān)，較少發(fā)生于 CBF（核心結(jié)合因子）白血病［7，8］。在 FAB分型M3亞型中，F(xiàn)lt3-ITD突變常伴有很高的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、高比例的骨髓原始細(xì)胞和高水平的乳酸脫氫酶，這些都與預(yù)后不良有關(guān)。在兒童AML，尤其是小于10歲患者，F(xiàn)lt3-ITD發(fā)生較少，且預(yù)后差。在成人AML中，ITD突變隨著年齡的增加而增加。表明Flt3-ITD以不同于野生型Flt3的方式激活Bcl-2家族成員，從而活化不同的抗凋亡通路［9］。Flt3-ITD可以阻斷細(xì)胞分化，用選擇性激酶Flt3抑制劑處理可解除此阻斷。

2.1.2 C-KIT突變 人類C-KIT是由約70 kb大小的C-KIT原癌基因編碼的跨膜受體。該受體由976個(gè)氨基酸組成，分膜外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)3部分，屬Ⅲ型酪氨酸激酶受體家族，其配體為干細(xì)胞因子（SCF）。C-KIT/SCF系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)造血干/祖細(xì)胞的增殖分化及細(xì)胞凋亡等多個(gè)復(fù)雜的生物過程。Gare等在110例CBF-AML患者發(fā)現(xiàn)有KIT突變，8號(hào)外顯子突變占inv16患者的24%，而在t（8;21）患者中僅占2%。盡管C-KIT 8號(hào)外顯子突變激活的本質(zhì)尚未揭示，但酪氨酸激酶受體的突變并不是均勻分布于不同類型的AML中，其與相伴隨的轉(zhuǎn)錄因子的分子改變是相互依賴和高度特異的。

2.1.3 Ras突變 自1984年在AML患者中首次發(fā)現(xiàn)N-Ras突變后，關(guān)于Ras蛋白前兩個(gè)外顯子的突變已有較多報(bào)道，如N-Ras 12、13、61號(hào)密碼子的突變，偶發(fā)于K-Ras，極少發(fā)生于H-Ras。近期一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，N-Ras和K-Ras突變分別占AML患者的9.7%、2.9%，而且伴 Ras突變的 AML患者在初診時(shí)WBC計(jì)數(shù)顯著升高，Ras突變在M4或M5（FAB分型）中的出現(xiàn)頻率遠(yuǎn)高于其他亞型，且極少與Flt3-ITD突變共存［10］。對(duì)骨髓增生異常綜合征（MDS）患者進(jìn)行Ras突變分析發(fā)現(xiàn)，具有N-Ras突變的患者易發(fā)展成AML，說明Ras突變是MDS病情發(fā)展的重要因素。Ras的致癌形式可通過p53途徑抑制原始細(xì)胞的增殖。

2.2 轉(zhuǎn)錄因子的改變 在初發(fā)AML患者中，50%可見染色體斷裂產(chǎn)生的融合基因。AML特異的染色體易位與突變的靶基因是一些轉(zhuǎn)錄因子，可導(dǎo)致AML細(xì)胞的分化阻斷。轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子，可與無關(guān)蛋白融合引起轉(zhuǎn)錄水平的抑制。這些突變不僅影響了骨髓細(xì)胞的分化，而且通過影響細(xì)胞周期與凋亡機(jī)制中關(guān)鍵分子的表達(dá)或其功能的飾變參與細(xì)胞的增殖與存活。

2.2.1 CBF白血病與 AML1-ETO 約在 25%的AML患者中可見CBF復(fù)合體被t（8;21）、inv16和t（16;16）易位所打斷。CBF由兩個(gè)亞基組成:AML1，21q22編碼;CBFβ，16q22 編碼。AML1 具有結(jié)合DNA的能力，可以充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活子。AML1和CBFβ是維持正常血細(xì)胞發(fā)育所必需的。最常見的AML易位是t（8;21），在成人中占10% ～15%，它導(dǎo)致AML1的C末端被轉(zhuǎn)錄抑制子ETO所取代，產(chǎn)生融合蛋白AML1-ETO，ETO能夠結(jié)合一些共抑制子（NcoR，SMRT）和組蛋白脫乙酰化酶。組蛋白脫乙酰化酶可引起DNA構(gòu)象的變化，使得轉(zhuǎn)錄不易進(jìn)行，從而導(dǎo)致AML1靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制及細(xì)胞分化的阻斷。

靶基因分析表明，AML1誘導(dǎo)而AML1-ETO抑制基因是中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落刺激因子，如IL-3和NP3。AML1-ETO還影響其他轉(zhuǎn)錄因子（如C/EBPα和轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1等）的表達(dá)和功能。C/EBPα是一個(gè)重要的中性粒細(xì)胞分化因子，AML1-ETO可下調(diào)其表達(dá)水平，從而抑制其功能。研究表明，C/EBPα單一等位基因的突變見于MDS來源的 AML，而雙等位基因的突變見于原發(fā)AML［11］。c-Kit聯(lián)合 AML1-ETO 突變可以誘導(dǎo)小鼠形成 AML［12］。研究表明，AML1-ETO 可直接抑制p14的表達(dá)，p14可誘導(dǎo)p53依賴型的細(xì)胞增殖和分化。對(duì)不同細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)，AML1-ETO可上調(diào)Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡或下調(diào)Bcl-2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?？傊?，AML1-ETO并不僅僅抑制造血祖細(xì)胞的分化，而且還對(duì)細(xì)胞的凋亡、增殖、自我更新及細(xì)胞特定類型的分化有重要作用。

2.2.2 APL與 PML-RARα APL占所有 AML的10%，染色體t（15;17）易位是其典型特征，約占99%。其易位導(dǎo)致17q12的RARα基因與PML編碼序列相連，產(chǎn)生PML-RARα融合蛋白。其他極少發(fā)生的易位為t（11;17）（q23;q12）、t（5;17）（q35;q12）、t（17;17）（q11;q12）或 t（11;17）（q13;q12），分別產(chǎn)生 PLZF-RARα、NPM-RARα、NuMA-RARα 和STAT5b-RARα 融合基因［13］。

RARα是一個(gè)核激素受體，它通過募集共抑制子和組蛋白脫乙?；竵硪种妻D(zhuǎn)錄。維甲酸與RARα結(jié)合后可釋放共抑制子和組蛋白脫乙?；福蔀檗D(zhuǎn)錄激活子。融合蛋白PML-RARα可破壞RARα與維甲酸之間的正常反應(yīng)，可能的原因是大量融合分子及其蛋白與蛋白之間相互作用的改變破壞了轉(zhuǎn)錄抑制子與激活子轉(zhuǎn)換所必需的構(gòu)象改變。高濃度的維甲酸可將PML-RARα轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活子，從而誘導(dǎo)APL細(xì)胞的分化。臨床上應(yīng)用全反式維甲酸可以誘導(dǎo)APL患者產(chǎn)生快速的分化反應(yīng)。然而，對(duì)小鼠骨髓的研究發(fā)現(xiàn)，僅僅過表達(dá)PML-RARα不足以誘導(dǎo)其產(chǎn)生未分化的表型。只有15%～20%的小鼠移植此骨髓后產(chǎn)生具有未分化特征的疾病，而其他大多數(shù)小鼠只是產(chǎn)生骨髓增殖紊亂［14］。這表明有其他基因參與了細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程。此外，PML-RARα與FLT3-ITD突變的共表達(dá)極大地增強(qiáng)受體小鼠APL的外顯率，盡管FLT3-ITD重組小鼠從未產(chǎn)生急性白血病相關(guān)疾病，再次表明兩種突變之間的相互作用［15］。

2.3 混合譜系白血病基因（MLL）異常及其相關(guān)融合基因

MLL位于染色體11q23，編碼一個(gè)與胚胎發(fā)育調(diào)控有關(guān)的DNA結(jié)合蛋白，具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，主要包括3個(gè)功能區(qū)域:轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)、轉(zhuǎn)錄激活區(qū)和DNA結(jié)合區(qū)。MLL具有轉(zhuǎn)錄因子功能，在人類發(fā)育和細(xì)胞分化過程中起著重要調(diào)控作用。累及MLL基因的分子異常見于5.2%AML、22%ALL和80%以上小于24個(gè)月的小兒白血病。MLL中11q23重排的兒童5年生存率為44%［16］。MLL基因涉及60余種染色體易位，產(chǎn)生不同的融合蛋白，且每種融合蛋白都與特定的白血病表型相關(guān)。常見的有ALL中的MLL-AF4融合基因t（4;11）（p21;q23）、AML中的MLL-AF9融合基因t（9;11）（p22;q23）、AML及ALL的MLL-ENL融合基因t（11;19）（q23;p13）［17］。

2.4 融合基因的靶基因與Wnt信號(hào)通路 如前所述，對(duì)融合蛋白靶基因的分析為其在白血病轉(zhuǎn)化中的作用提供了重要線索。近年來許多實(shí)驗(yàn)開始對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)論證。由于其對(duì)白血病的致病機(jī)制是相似的，因而有理由相信它們可能擁有一些共同的靶基因。較單個(gè)融合蛋白的靶基因能夠解釋AML不同亞型而言，共同的靶基因可能編碼了更多的致病相關(guān)蛋白。Park等［18］對(duì) PML-RARα 和 PLZF-RARα共同靶基因的分析發(fā)現(xiàn)，其調(diào)節(jié)凋亡的基因包括腫瘤壞死因子受體Ⅱ（TNFR2）和腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白基因。

對(duì)U937細(xì)胞中融合蛋白 AML1-ETO、PML-RARα和PLZF-RARα的共同靶基因分析發(fā)現(xiàn)，被這三種融合蛋白調(diào)節(jié)的幾個(gè)基因與Wnt信號(hào)通路有關(guān)。參與Wnt信號(hào)通路的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子為盤狀球蛋白，這三種融合蛋白都可以誘導(dǎo)其mRNA的產(chǎn)生，其轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)可以進(jìn)一步誘導(dǎo)Wnt信號(hào)通路中的靶基因。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，它可以增強(qiáng)骨髓祖細(xì)胞的自我更新與白血病發(fā)生。這些結(jié)果表明，Wnt信號(hào)通路的活化是AML中幾種染色體易位的共同特征。由于Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中許多靶基因?yàn)樵鰪?qiáng)細(xì)胞增殖的癌基因，因而這成為融合基因在AML發(fā)生中除阻斷分化之外所扮演的另一角色。

隨著基因表達(dá)譜分析和RNA干擾（RNAi）技術(shù)在這一領(lǐng)域的應(yīng)用，基于RNAi的白血病癌基因的表達(dá)抑制具有誘人的應(yīng)用前景［19］。Heidenreich等［20］用特異性靶向 siRNA可降低 40% ～80%AML1/ETO mRNA的表達(dá)，在分化誘導(dǎo)劑 TGF-β1和維生素D3的作用下，骨髓細(xì)胞的分化阻斷可被逆轉(zhuǎn)。這種抑制效果同樣在伴有t（15;17）的APL細(xì)胞PML/RARa融合基因中發(fā)現(xiàn)。伴隨對(duì)白血病發(fā)生過程中信號(hào)傳導(dǎo)分子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控子結(jié)構(gòu)與功能的研究，必將推動(dòng)白血病臨床個(gè)性化診斷與治療，為其靶向基因治療提供分子依據(jù)。

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