陸振華，周亞星

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，其中80%～90%為原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌，全世界每年大約有1 000 000人死于肝癌，其中老年人是高發(fā)人群[1]。目前認(rèn)為，肝癌最主要是由病毒感染所致[2]。當(dāng)前，肝癌的發(fā)病機(jī)制尚未十分明了，人們普遍認(rèn)為抑癌基因的異常失活或癌基因的激活是導(dǎo)致肝癌發(fā)生的主要原因。microRNA(miRNA)是一類新近發(fā)現(xiàn)的長度為17～25個核昔酸的非編碼小分子RNA。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤致病過程中起著及其重要的調(diào)節(jié)功能，且其與腫瘤分化有密切關(guān)系[3]。miRNA-21是較早發(fā)現(xiàn)的的人類miRNA之一，其在胰腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤血漿中明顯上調(diào)，但是，miRNA-21在原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者組織以及血漿中的報道尚少。本研究對比了miRNA-21在老年肝細(xì)胞癌及對應(yīng)癌旁組織與乙肝肝硬化患者中的表達(dá)，分析其在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平及其與臨床病理特征的聯(lián)系，探討其在老年肝細(xì)胞癌診治及預(yù)后方面的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 所有組織來源于2011年8月至2013年8月期間在泰州市人民醫(yī)院治療的老年患者的手術(shù)切除標(biāo)本。其中，研究組30例，其中男13例，女17例，年齡62～78歲，平均年齡(68.12±7.20)歲。HbsAg均為陽性，術(shù)前均未經(jīng)任何介入或化療等任何處理，所有患者均接受肝癌根治性切除手術(shù)處理，所有組織標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理學(xué)證實為肝細(xì)胞癌，分別取肝癌及對應(yīng)癌旁組織待用。HCC組織根據(jù)Edmondson標(biāo)準(zhǔn)分級：Ⅰ級8例；Ⅱ級12例；Ⅲ級10例；Ⅳ級10例。對照組為同期乙肝肝硬化患者30例，其中男15例，女15例，年齡64～79歲，平均年齡(69.23±7.16)歲，HbsAg均為陽性，經(jīng)病理診斷為肝硬化。兩組的性別、年齡等臨床資料相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。所有標(biāo)本于術(shù)中離體30 min內(nèi)取材，經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片備用。

1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒Trizol購于Gibco公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Femantes公司；DNA Marker、PCR試劑盒、焦碳酸二乙脂(DEPC)均購于生興生化科技(南京)有限公司。miRNA-21及U6內(nèi)參的引物均由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計并提供。

1.3 組織及血漿標(biāo)本總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 研究組術(shù)中取肝癌及對應(yīng)癌旁組織；對照組取肝硬化組織。此外，清晨空腹時抽取各研究對象的外周靜脈血5 ml，加入EDTA抗凝劑，2 h內(nèi)予高速離心，離心條件為：4 ℃，4 000 g，5 min。離心后提取上層血漿置EP管中放入-80 ℃保存?zhèn)溆?。取約100 mg組織或250 μl血漿，加入1 ml Trizol，充分勻漿，抽提總RNA，所得RNA溶于20 μl DEPC處理水。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計進(jìn)行定量及檢測純度。進(jìn)一步用Femantes逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)條件：95℃變性20 s，然后60℃ 20 s和70℃ 1s進(jìn)行40個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，本組資料以表示，組間比較采用t檢驗，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織及對應(yīng)癌旁以及乙肝肝硬化組織中miRNA-21的表達(dá)水平 具體數(shù)據(jù)見表1。由表1可見，與乙肝肝硬化組織比較，miRNA-21在癌旁組織中的mRNA表達(dá)水平顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.72，P<0.05)；與癌旁組織比較，miRNA-21在肝癌組織中mRNA的表達(dá)水平顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.66，P<0.05)。

表1 肝癌及對應(yīng)癌旁及乙肝肝硬化組織中miRNA-21 mRNA的表達(dá)水平

2.2 肝癌以及乙肝肝硬化患者血漿中miRNA-21 mRNA的表達(dá)水平 具體數(shù)據(jù)見表2。由表2可見，miRNA-21在肝癌患者血漿中mRNA表達(dá)水平顯著高于乙肝肝硬化患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.98，P<0.05)。

表2 肝癌患者以及乙肝肝硬化患者血漿中microRNA-21 mRNA的表達(dá)

2.3 肝癌組織及血漿中miRNA-21表達(dá)水平與肝癌組織病理分級的相關(guān)性 進(jìn)一步采用相關(guān)分析結(jié)果顯示肝癌組織中miRNA-21 mRNA表達(dá)水平與HCC分化程度顯著正相關(guān)(r=0.685，P<0.05)，而肝癌患者癌旁組織中miRNA-21 mRNA表達(dá)水平與與HCC分化程度均無顯著相關(guān)(r=0.125，P>0.05)，見表3。血漿中miRNA-21 mRNA表達(dá)水平與HCC分化程度顯著正相關(guān)(r=0.603，P<0.05)，見表4。

表3 組織中miRNA-21 mRNA表達(dá)強(qiáng)度與HCC分化程度的關(guān)系

表4 血漿中miRNA-21 mRNA表達(dá)強(qiáng)度與HCC分化程度的關(guān)系

3 討論

miRNA廣泛的存在于組織、血漿或血清以及其他體液中，由于不易被內(nèi)源性的核糖核酸酶所降解，其在體內(nèi)表達(dá)比較穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)miRNA既具有抑癌基因又具有癌基因的特性，其可對一系列重要的抑癌或者促癌基因的起著重要的調(diào)控作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-21與乳腺癌、胰腺癌、肺癌、多形性惡性膠質(zhì)瘤、胃癌、結(jié)直腸癌等存在高度相關(guān)性，在惡性腫瘤中起著癌基因的重要功能[5-7]。進(jìn)一步說明了miRNA-21在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后中具有及其重要的作用。

原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個涉及到多基因、多通路、多步驟的復(fù)雜過程。一般認(rèn)為導(dǎo)致肝癌發(fā)生的主要原因為抑癌基因的異常失活或者致癌基因的激活，然而其具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過檢測miRNA-21在老年肝癌患者肝組織及對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在肝癌組織中的表達(dá)水平均顯著高于對應(yīng)的癌旁組織以及肝硬化患者，其在肝癌組織中的表達(dá)與肝癌Edmonson分級顯著相關(guān)。此外，患者血漿中miRNA-21表達(dá)水平亦與肝癌的臨床分期顯著正相關(guān)，均說明了miRNA-21在肝癌患者癌組織以及血漿中的表達(dá)程度與肝癌的細(xì)胞的增殖能力和惡性程度有著密切的聯(lián)系，從而提示了miRNA-21在肝癌的診斷、分級以及預(yù)后評價可能起著重要的作用。Meng等[8]在分析肝癌組織表達(dá)譜時發(fā)現(xiàn)miRNA-21較對照組顯著上調(diào)，并從體外實驗進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miRNA-21能增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力，這與本研究研究結(jié)果一致。

綜上所述，miRNA-21在肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，老年肝癌患者癌組織以及血清中miRNA-21的檢測對于對患者臨床個體化治療以及預(yù)后可能具有一定的指導(dǎo)意義。

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