王 鵬， 王文艷， 田 璐， 趙改名， 李苗云， 孫靈霞， 柳艷霞

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 河南 鄭州 450002；2.河南省肉制品加工與質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

冷卻豬肉以其營養(yǎng)豐富、鮮香、利于人體吸收等優(yōu)勢成已為生鮮豬肉一種新的消費(fèi)形態(tài)[1].冷卻肉在0～4 ℃的低溫環(huán)境中貨架期較長[2].但目前中國冷鏈系統(tǒng)并不完善，當(dāng)在貯藏、運(yùn)輸?shù)冗^程中出現(xiàn)控制不當(dāng)或溫度波動時，微生物會迅速增殖，加速鮮肉變質(zhì)[3,4].氣調(diào)包裝(MAP)是延長冷卻肉貨架期的有效的方法，合理的氣調(diào)包裝不但可以延長貨架期還可以提高冷卻肉的感官品質(zhì)[5].氣調(diào)包裝中常用的氣體成分主要是CO2，O2和N2，氧氣的體積分?jǐn)?shù)超過60%才能保持肉的色澤，二氧化碳不低于25%才能有效地抑制細(xì)菌的繁殖[6].目前，生鮮肉中常用的氣體比例多是高氧的CO2和O2的混合，而當(dāng)氣體比例中CO2為30%～50%，氧氣為50%～70%時，冷藏3 d后逐漸產(chǎn)生異味[7]，對冷卻肉的保鮮效果差異較大.

響應(yīng)面分析法是通過有限次數(shù)試驗(yàn)來獲取各個因素條件下的試驗(yàn)結(jié)果[8]，進(jìn)而采用多元二次回歸方程來擬合各因素與響應(yīng)值之間的對應(yīng)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最佳試驗(yàn)條件，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法[9～11].目前關(guān)于氣體比例優(yōu)化的研究較多，但是通過響應(yīng)面來優(yōu)化氣調(diào)包裝冷卻肉氣體比例的研究還較少.反映冷卻豬肉在貯藏期間的品質(zhì)指標(biāo)很多，其中細(xì)菌總數(shù)能夠反映肉中微生物的增殖和新鮮程度，亮度值(L*)、紅度值(a*)直接反映肉色的變化，pH值和電導(dǎo)率可反映肉新鮮度的變化[12].因此，本試驗(yàn)以CO2和O2為單因素，用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)，測定細(xì)菌總數(shù)，L*，a*，pH值，電導(dǎo)率，以上5個指標(biāo)分別作為響應(yīng)值，優(yōu)化氣體比例，為工業(yè)化氣調(diào)包裝氣體比例提供理論依據(jù)，為延長冷卻豬肉貨架期提供有效手段.

1 材料與方法

1.1材料

豬背最長肌，河南某肉品企業(yè)生產(chǎn)，隨機(jī)采取屠宰后24 h經(jīng)過預(yù)冷后分配到鄭州某超市配送中心的大排肌肉，用保鮮膜包裹，放置于裝有冰袋的保溫箱中，1 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室.

1.2主要儀器與設(shè)備

氣調(diào)保鮮包裝機(jī)(DT-6S)，大江機(jī)械設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱(SPX-ISOSH)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；均質(zhì)機(jī)(Easy Mix)，法國AES公司；無菌操作臺(SW-CJ-2F)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9272)，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；色彩色差計(jì)(CR-400)，日本KONICAMINOLTA公司；電導(dǎo)率儀(DDSJ-308A)，上海雷磁儀器有限公司；離子計(jì)(SJ-216)，上海精科儀器有限公司；回旋式振蕩器(HY-5)，金壇市杰瑞爾電器有限公司.

1.3方法

1.3.1 取樣及試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別取200 g肉樣裝入氣調(diào)包裝盒中(希悅爾包裝有限公司),TQBC-0755，用氣調(diào)保鮮包裝機(jī)包裝(上充氣2.0，下充氣1.0)，置于7 ℃貯藏，每2 d取樣分析.以CO2和O2的比例作為影響因素做單因素試驗(yàn).分為以下5組，氣體比例分別為：1)20%CO2+60%O2+20%N2; 2) 30%CO2+50%O2+20%N2; 3)40%CO2+40%O2+20%N2; 4)50%CO2+30%O2+20%N2; 5)60%CO2+20%O2+20%N2.

1.3.2 細(xì)菌總數(shù)的測定 在無菌操作臺里完成所有消毒過程后，稱取25 g肉樣，放入均質(zhì)袋中，用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)100 s.參考6×6點(diǎn)樣法[13]，取100 μL菌懸液按1∶10進(jìn)行倍比稀釋，選取4個合適的稀釋度，取10 μL菌懸液點(diǎn)在倒有培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行微生物測定，每個稀釋度4個平行.每組樣品做5次平行.放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)并記錄數(shù)據(jù).

1.3.3 肉色的測定 用色彩色差計(jì)進(jìn)行肉色測定并依次記錄亮度值(L*)，紅度值 (a*).

1.3.4 pH值的測定 稱取絞碎肉樣10 g，加入100 mL蒸餾水，用回旋式振蕩器振蕩30 min，過濾后將濾液轉(zhuǎn)移至100 mL的燒杯，用離子計(jì)測定濾液的pH值，記錄數(shù)據(jù).

1.3.5 電導(dǎo)率的測定 樣品處理方法同1.3.4，用電導(dǎo)率儀測定濾液電導(dǎo)率值，記錄數(shù)據(jù).

1.4數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件和Design Expert 7.0響應(yīng)面軟件處理.

2 結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 細(xì)菌總數(shù)的變化 如圖1所示，對于不同的氣體比例氣調(diào)包裝下的冷卻豬肉而言，細(xì)菌總數(shù)生長速度各有不同，對腐敗的影響也有一定的差異.在初始條件基本一致的條件下，含有20%CO2的氣調(diào)包裝冷卻豬肉生長速度最快，第6天時細(xì)菌總數(shù)已經(jīng)超過106cfu·g-1，對應(yīng)感官評定結(jié)果，到第8 d就有異味了，在貯藏12 d時細(xì)菌總數(shù)達(dá)到7.76 log (cfu·g-1)，說明貨架期為6 d.CO2體積分?jǐn)?shù)在20%～40%時，細(xì)菌總數(shù)的生長逐漸緩慢，40% CO2時最慢，30% CO2貯藏12 d細(xì)菌總數(shù)達(dá)到7.76 log(cfu·g-1)，40% CO2到16 d時細(xì)菌總數(shù)為8.31 log (cfu·g-1).相對于40% CO2的效果，50%和60%CO2的生長速度緩慢，但遲滯期較短，沒有明顯的延長冷卻豬肉貨架期的作用，50%和60%CO2在14 d時分別為8.21 log(cfu·g-1)和7.99 log(cfu·g-1).

圖1 不同氣體比例冷卻豬肉細(xì)菌總數(shù)的變化

2.1.2 肉色的變化 如表1所示，對于不同的氣體比例而言，隨著貯藏時間的延長，生鮮豬肉的亮度在貯藏期間總體呈現(xiàn)上升的趨勢.從表中可以明顯的看到在整個貯藏期，40% CO2比其他組別的L*值低.而其他組別之間沒有明顯差別.20% CO2貯藏在10 d時突變?yōu)?7.09，30%與40% CO2貯藏在14 d時分別為58.76和58.29.50%與60% CO2貯藏在16 d時分別為59.30和59.01.

在貯藏初期，a*值都會上升，這是因?yàn)闅怏w比例中都含有氧氣，使肉色變紅(肌紅蛋白的變化)，但是隨著貯藏時間的延長都會下降，趨勢都是相似的.30% CO2和40% CO2在整個貯藏期間的a*值都比較高，20% CO2貯藏2 d時a*值最高7.51，在第8 d下降.30% CO2貯藏在6 d時a*值最高9.29，在第8 d下降40% CO2貯藏在10 d時a*值最高9.75，在第12 d下降，50% CO2貯藏在6 d時a*值最高7.60，在12 d下降.60% CO2貯藏在4 d時a*值最高9.23，在第8 d下降，說明30%～40% CO2對肉樣具有很好的護(hù)色作用.

表1 冷卻豬肉顏色的測定結(jié)果

2.1.3 pH值的變化 屠宰后的畜肉，由于本身肌肉組織細(xì)胞的呼吸活動，在貯藏初期，不同肉樣的pH值由于肌糖原的無糖酵解和ATP的分解，乳酸和磷酸的含量增加，使pH值略有下降，而后常規(guī)條件下基本上都隨著貯藏時間的延長逐漸升高，但在氣調(diào)包裝中由于CO2與汁液接觸，形成碳酸而降低了pH值.如圖2所示，但不同的氣體比例對pH值產(chǎn)生的影響也具有一定的差異.剛宰后的熱鮮肉pH值約為7.0，經(jīng)24 h降至5.6～6.0，并一直維持到肉腐敗分解之前.本次試驗(yàn)中所選取的樣品是在包裝前已經(jīng)完成了成熟過程，試驗(yàn)的肉樣初始pH值基本一致在5.4～5.8，在貯藏過程中肉類蛋白質(zhì)被微生物的蛋白分解酶分解成胺類等堿性含氮物，使pH值升高，但是CO2的作用使得pH值降低.

如圖2所示，所有組別的pH值都沒有太大的波動，因?yàn)榘b中含有CO2，所以pH值一直都處于5～6，40% CO2時pH值最低，其他都稍微有所升高.說明在40%CO2時達(dá)到了很好的抑菌效果.

2.1.4 電導(dǎo)率的變化 如圖3所示，在5組氣調(diào)包裝冷卻豬肉肉浸出液的電導(dǎo)率值都是隨天數(shù)的增加而不斷增加.這說明隨著時間的延長，肌肉中的導(dǎo)電物質(zhì)不斷增加，這是肌肉中帶電物質(zhì)不斷分解的結(jié)果.20% CO2與30% CO2基本相似，20%CO2貯藏12 d時電導(dǎo)率為0.071S·m-1， 30%CO2和40% CO2貯藏14 d時電導(dǎo)率值分別為0.084 S·m-1和0.096 S·m-1.但是50% CO2與60% CO2的電導(dǎo)率值明顯比較大，50% CO2貯藏14 d時電導(dǎo)率值達(dá)到0.14 S·m-1，60% CO2貯藏12 d時電導(dǎo)率值達(dá)到0.144 S·m-1.說明隨著CO2比例的增加，汁液損失越多，溶出很多帶電物質(zhì)，導(dǎo)致電導(dǎo)率增加.很多人用電導(dǎo)率作為豬肉新鮮度的指標(biāo)，電導(dǎo)率值確實(shí)可以反映腐敗的進(jìn)程.

圖2 不同氣體比例冷卻豬肉pH值的變化

綜合各個指標(biāo)發(fā)現(xiàn)氣體比例為40%CO2+40%O2+20%N2時效果較好.

圖3 不同氣體比例冷卻豬肉電導(dǎo)率的變化

2.2響應(yīng)曲面優(yōu)化氣體比例

根據(jù)中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn)(Central Composite Design， CCD)原理[12]，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design Expert 7.0進(jìn)行中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn).設(shè)CO2(A),O2(B)2個因素為自變量，細(xì)菌總數(shù)(Y1)，L*(Y2)，a*(Y3)，pH值(Y4)，電導(dǎo)率(Y5)分別為響應(yīng)值，以此來優(yōu)化氣調(diào)包裝冷卻豬肉的比例，并通過Design Expert軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測最佳比例[13].設(shè)計(jì)內(nèi)容如表2,3所示.

表2 設(shè)計(jì)因素及其水平表

2.2.1 基于細(xì)菌總數(shù)優(yōu)化氣體比例 利用Design Expert 7.0軟件，將細(xì)菌總數(shù)(Y1)進(jìn)行二次多元逐步回歸擬合，得出回歸方程(1).

Y1=5.61-0.25A+0.73B-0.085AB+0.32A2+1.04B2

(1)

表3 2因素5水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)氣體比例

對回歸模型進(jìn)行方差分析(表4)，結(jié)果表明，回歸模型的P<0.05，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.887 7，R2越接近1，說明試驗(yàn)?zāi)Ｐ团c真實(shí)值之間的相關(guān)性越好.此模型可解釋81%的變異，擬合度良好，具有實(shí)踐指導(dǎo)意義.從A項(xiàng)、B項(xiàng)、A2項(xiàng)、B2項(xiàng)的數(shù)值和對比來看，二氧化碳和氧氣對細(xì)菌總數(shù)都有影響，但氧氣的影響明顯大于二氧化碳.正的平方項(xiàng)系數(shù)所對應(yīng)的拋物線開口向上，可以取得最小值，可進(jìn)行優(yōu)化分析.由此優(yōu)化的氣體比例為：CO239%+O237%+N224%.

2.2.2 基于L*值優(yōu)化氣體比例 將L*(Y2)的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元逐步回歸擬合，得到優(yōu)化氣體比例的最優(yōu)值的二次多項(xiàng)回歸方程(2).

Y2=52.03-1.17A+1.41B+0.77AB+1.32A2+1.97B2

(2)

表4 細(xì)菌總數(shù)的回歸方程的方差分析

對回歸模型進(jìn)行方差分析(表5)，結(jié)果表明，回歸模型的P<0.05，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.915 1，模型預(yù)測值與真實(shí)值之間的相關(guān)性好.此模型可解釋85%的變異，擬合度良好.從A項(xiàng)，B項(xiàng)、A2項(xiàng)、B2項(xiàng)的對比來看，氧氣的影響大于二氧化碳的影響.正的平方項(xiàng)系數(shù)所對應(yīng)的拋物線開口向上，可以取得最小值，可進(jìn)行優(yōu)化分析.由此優(yōu)化的氣體比例為：CO233%+O239%+N228%.

圖4CO2和O2對應(yīng)的細(xì)菌總數(shù)值的等高線圖和響應(yīng)曲面圖

Fig.4ThecontourmapandresponsesurfaceplotofCO2andO2tothetotalbacteria

表5 L*值的回歸方程的方差分析

圖5 CO2和O2對應(yīng)的L*值的等高線圖和響應(yīng)曲面圖

2.2.3 基于a*值優(yōu)化氣體比例 將a*(Y3)的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元逐步回歸擬合，得到優(yōu)化氣體比例的最優(yōu)值的二次多項(xiàng)回歸方程(3).

Y3=9.26-0.16A+0.013B-0.55AB-1.15A2-1.27B2

(3)

對回歸模型進(jìn)行方差分析(表6)，結(jié)果表明，回歸模型的P<0.05，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.908 1，預(yù)測值與真實(shí)值之間的相關(guān)性好.此模型可解釋84%的變異，擬合度良好.從A項(xiàng)、AB項(xiàng)、A2項(xiàng)、B2項(xiàng)的對比來看，氧氣的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于二氧化碳的影響，而冷卻豬肉的紅度值與氧含量相關(guān)，氧氣主要氧合肌紅蛋白，促使肉品保持鮮紅肉色.由圖3可以看出，負(fù)的平方項(xiàng)系數(shù)所對應(yīng)的拋物線開口向下，可以取得最大值，則可進(jìn)行優(yōu)化分析.由此得出的優(yōu)化氣體比例為：CO243%+O237%+N220%.

表6 a*值的回歸方程的方差分析

圖6 CO2和O2對應(yīng)的a*值的等高線圖和響應(yīng)曲面圖

2.2.4 基于pH值優(yōu)化氣體比例 將pH值(Y4)進(jìn)行二次多元逐步回歸擬合，得到優(yōu)化氣體比例最優(yōu)值的二次多項(xiàng)回歸方程(4).

Y4=5.58+0.091A-0.042B-003AB-0.035A2+0.13B2

(4)

對回歸模型進(jìn)行方差分析(表7)，結(jié)果表明，回歸模型的P<0.05，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.964 1，預(yù)測值與真實(shí)值之間的相關(guān)性好.此模型的校正R2為0.938 4，可解釋94%的變異，說明此模型擬合度很好.正的平方項(xiàng)系數(shù)比負(fù)的平方項(xiàng)系數(shù)的絕對值大，但響應(yīng)曲面仍可取的最小值，可進(jìn)行優(yōu)化分析.由此優(yōu)化的氣體比例為：CO237%+O241%+N222%.

表7 pH值的回歸方程的方差分析

圖7CO2和O2對應(yīng)的pH值的等高線圖和響應(yīng)曲面圖

Fig.7ThecontourmapandresponsesurfaceplotofCO2andO2topH

表8 電導(dǎo)率的回歸方程的方差分析

2.2.5 基于電導(dǎo)率值優(yōu)化氣體比例 將電導(dǎo)率(Y5)進(jìn)行二次多元逐步回歸擬合，得到優(yōu)化氣體比例最優(yōu)值的二次多項(xiàng)回歸方程(5)(其中A為CO2，B為O2).

Y5=763.00-22.44A-2.49B+43.75AB+222.63A2+271.38B2

(5)

結(jié)果表明，回歸模型的P<0.000 1，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.993 0，此模型擬合度非常好.在方差分析中，正的平方項(xiàng)系數(shù)表明，方程的拋物線開口向上，具有極小值點(diǎn)，可進(jìn)行優(yōu)化分析.由此優(yōu)化氣體比例為：CO232%+O240%+N228%.

肉類富含蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，是高度容易腐爛變質(zhì)的產(chǎn)品，雖然低溫條件下一些微生物生長受到抑制，但是仍然存在大量不同種類的微生物.氣體比例對冷卻豬肉中微生物的生長影響非常大，很多學(xué)者是通過單一的氣體含量進(jìn)行研究[14,15],本研究探討的是CO2與O2比例的保鮮效果，這樣更接近實(shí)際情況，更清楚地了解CO2與O2相互作用下冷卻豬肉的保鮮效果.CO2與 O2比例為1∶1時紅度值較高，說明護(hù)色效果很好，有學(xué)者報道O2超過35%時，顏色效果較好，超過45%時則效果不明顯，可能是由于肉表面氧化肌細(xì)胞色素的飽和所致[16].不同含量的CO2對pH值有一定的影響，而隨著CO2含量的升高，溶出物質(zhì)增多，會導(dǎo)致電導(dǎo)率有所波動，有不少學(xué)者認(rèn)為電導(dǎo)率可以作為新鮮度指標(biāo)[17,18].綜合各個指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得出的結(jié)果更有利于實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用.

圖8 CO2和O2對應(yīng)的電導(dǎo)率值的等高線圖和響應(yīng)曲面圖

3 結(jié)論

本研究建立和優(yōu)化了細(xì)菌總數(shù)、L*，a*，pH值和電導(dǎo)率的逐步回歸模型，各個模型均具有顯著性，可為實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù).通過回歸方程優(yōu)化了氣體比例，CO2介于32%～43%，O2介于37%～41%，其余為相對應(yīng)的N2，冷卻豬肉在貯藏期間可保持良好品質(zhì).

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