占申標(biāo)呂穎慧，2李招發(fā)，2

（1.華僑大學(xué)分子藥物研究院，泉州 362021；2.分子藥物教育部工程研究中心，泉州 362021）

腺相關(guān)病毒Rep78/68蛋白功能的研究進(jìn)展

占申標(biāo)1呂穎慧1，2李招發(fā)1，2

（1.華僑大學(xué)分子藥物研究院，泉州 362021；2.分子藥物教育部工程研究中心，泉州 362021）

Rep78/68是腺相關(guān)病毒（AAV）基因組編碼的具有多種調(diào)控功能的非結(jié)構(gòu)蛋白。主要參與了AAV DNA定點(diǎn)整合到人類(lèi)19號(hào)染色體，抑制病毒的生物活性，如腺病毒、類(lèi)猿病毒SV40等，調(diào)節(jié)AAV DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等。重點(diǎn)闡述了定點(diǎn)整合的作用機(jī)制，Rep78/AAV ITR /ICP8復(fù)合物的形成機(jī)制以及Rep68蛋白的寡聚化特性，Rep78蛋白對(duì)p53核輸出的限制，AAV Rep78蛋白與人乳頭瘤病毒（HPV）E1蛋白相互作用從而促使Rep78和ITR DNA的結(jié)合，Rep78對(duì)乙型肝炎病毒（HBV）的抑制。這些作用的詳細(xì)機(jī)制仍需完善和充實(shí)，對(duì)Rep78/68蛋白的相關(guān)作用機(jī)制的深入研究有助于rAAV基因藥物的研發(fā)。

AAV Rep78 Rep68 p53 機(jī)制

腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）為復(fù)制缺陷型病毒，是細(xì)小病毒家族的一個(gè)成員，具有一系列特征，能將基因組定點(diǎn)整合到人類(lèi)基因組19號(hào)染色體特定區(qū)域（19q13.42-qter）：AAVS1［1-3］，并且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與人類(lèi)疾病有關(guān)，是基因治療的理想載體［4］。AAV的有效感染通常需要輔助病毒的存在，如腺病毒（Ad）、皰疹病毒（herpes virus）和人乳頭瘤病毒（HPV）等［5］。AAV基因組為4.7 kb的單鏈DNA（ss-DNA），兩個(gè)末端是倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列（ITR），它是AAV基因組復(fù)制和包裝所必須的唯一順式作用元件［6，7］。ITR序列之間包含兩個(gè)開(kāi)放閱讀框架，稱(chēng)為Rep和Cap，分別編碼4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和3個(gè)結(jié)構(gòu)性蛋白（VP1、VP2和VP3）［8］。另外，Cap基因的開(kāi)放閱讀框2還編碼裝配激活蛋白（AAP）［9-11］。Rep78和Rep68蛋白在AAV的生命周期中扮演著相當(dāng)重要的角色，這兩個(gè)蛋白的深入研究，對(duì)重組腺相關(guān)病毒（rAAV）介導(dǎo)的基因治療意義深遠(yuǎn)?；诖耍疚闹饕U述了Rep78和Rep68蛋白一些相關(guān)作用的機(jī)制研究。

1 Rep78/68的結(jié)構(gòu)

4個(gè)非結(jié)構(gòu)的Rep蛋白分別由p5和p19啟動(dòng)子起始的mRNA通過(guò)選擇性剪接后翻譯而得。Rep78和它的剪接異構(gòu)體Rep68由p5啟動(dòng)子起始的2種mRNA翻譯，Rep52和它的剪接異構(gòu)體Rep40由p19啟動(dòng)子起始的2種mRNA翻譯［12］（圖1）。Rep52和Rep40蛋白C末端的氨基酸序列分別與Rep78和Rep68相同。Rep78/Rep68具有ATP酶和螺旋酶的活性結(jié)構(gòu)域。在輔助病毒存在時(shí)，兩個(gè)大的Rep蛋白序列和功能很是相似，Rep78/68蛋白可以和ITR中的特定序列結(jié)合。類(lèi)似的序列在AAV的3個(gè)啟動(dòng)子上游也都存在。這兩種蛋白對(duì)于AAV生活周期的每一時(shí)期都是必需的。能夠完成一系列復(fù)雜的功能，Rep蛋白肯定能與細(xì)胞內(nèi)的一些蛋白，以及輔助病毒的蛋白產(chǎn)生相互作用，迄今為止，對(duì)這些相互作用的研究還不是很透徹［13］。

2 Rep78/68協(xié)助AAV基因組定點(diǎn)整合

腺相關(guān)病毒能將基因組定點(diǎn)整合到人類(lèi)19號(hào)染色體上的特定位點(diǎn)AAVS1（圖2）。Surosky等［14］利用PCR技術(shù)鑒定得知，在一些特定的細(xì)胞中，AAV基因組能整合到AAVS1。通過(guò)這個(gè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是順式或者反式的AAV Rep蛋白，對(duì)于定點(diǎn)整合都起著決定性的作用。而且只有兩個(gè)大的Rep蛋白（Rep78和Rep68）參與了定點(diǎn)整合這一過(guò)程。另外，順式的AAV末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列（ITR）對(duì)于定點(diǎn)整合到AAVS1并非必不可少，但可以提高整合的效率。ITR包含一個(gè)Rep蛋白結(jié)合位點(diǎn)（RBS）和能被Rep蛋白的剪切活性識(shí)別的末端決定位點(diǎn)（TRS）［15］，RBS 由串聯(lián)重復(fù)序列的四聚物GAGC組成［14］，Rep78/68可特異識(shí)別（GAGC）4DNA序列，這一序列被稱(chēng)為Rep識(shí)別序列（RRS），人類(lèi)的19號(hào)染色體AAVS1就存在于RRS序列中。體外的結(jié)合試驗(yàn)表明：Rep78/68與AAV DNA結(jié)合以及剪切功能在AAV定點(diǎn)整合過(guò)程中發(fā)揮著很重要的作用，Rep78/68能夠調(diào)節(jié)AAV ITR 和AAVS1上包含RBS和TRS的一段109 bp的序列之間復(fù)合物的形成［16］。如果將RRS或TRS序列突變，定點(diǎn)整合就無(wú)法進(jìn)行［17］。其中，可以肯定有許多未知的胞內(nèi)蛋白也都參與了整合過(guò)程，但是至今還沒(méi)有研究清楚［17-19］。

通過(guò)一系列的體外或者體內(nèi)的試驗(yàn)都可以得到如下的結(jié)論：首先，AAV ITR和AAVS1中的RBS在Rep78/68的作用下得以靠近［16，20］；其次，形成Rep介導(dǎo)復(fù)合物，并且推測(cè)Rep78/68特異剪切ITR和AAVS1的特定位點(diǎn)；最后，以非同源重組的方式進(jìn)行位點(diǎn)整合［17，21］。

Surosky和Urabe等［14］驗(yàn)證了利用兩個(gè)質(zhì)粒來(lái)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合：分別是包含AAV ITR的質(zhì)粒和AAV Rep蛋白的質(zhì)粒。這個(gè)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是沒(méi)有病毒被包裝，也就沒(méi)有整合序列大小的限制，對(duì)于基因治療的發(fā)展頗有意義。

雖然Rep78/68對(duì)于AAV的定點(diǎn)整合和長(zhǎng)期有效表達(dá)是必須的，但還無(wú)法確定Rep78/68是否僅僅只促進(jìn)了定點(diǎn)整合這一過(guò)程，也許Rep78/68也作用于其他的一些隨機(jī)整合。由于Rep78/68能夠高效的與RBS結(jié)合，推測(cè)Rep78/68可能促進(jìn)隨機(jī)整合或者定點(diǎn)整合于與野生型RBS有一點(diǎn)相似的位點(diǎn)［22］。

Philpott等［23］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，AAV ITR不是介導(dǎo)定點(diǎn)整合的必要條件。在Rep78/68存在時(shí)，由于138 bp的順式P5整合效率元件（P5IEE）作用，定點(diǎn)整合依然會(huì)發(fā)生。為此，又提出最新的定點(diǎn)整合機(jī)制：Rep蛋白與AAVS1位點(diǎn)特異結(jié)合，發(fā)生剪切，出現(xiàn)AAVS1位點(diǎn)的擴(kuò)增和重排，而且Rep蛋白與AAV P5IEE結(jié)合，這樣兩個(gè)模板就相互靠近，在復(fù)制時(shí)發(fā)生置換或重組，定點(diǎn)整合也便得以進(jìn)行了［24］。

3 Rep78/Rep68調(diào)節(jié)AAV DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄

3.1 Rep78引導(dǎo)的Rep78/AAV ITR/ICP8三元復(fù)合物

的形成

單純皰疹病毒（HSV）的ICP8蛋白以及UL5/ UL18/UL52的解旋酶-引物酶復(fù)合體構(gòu)成的異源三聚體所形成的4個(gè)蛋白復(fù)合物參與了AAV DNA的復(fù)制［25］。其中，解旋酶UL5和引物酶UL52能夠吸引Rep蛋白和AAV基因組，從而起始AAV DNA的復(fù)制［26，27］。

Alex等［28-30］通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在體外，Rep78的C末端缺失的突變型仍有與ICP8和AAV ss-DNA相互作用的能力，而N末端缺失的突變型在體內(nèi)沒(méi)有顯示出促使AAV DNA復(fù)制的趨勢(shì)。Rep78的C末端主要包含了核定位信號(hào)序列，N末端則有與AAV ITR上RBS定點(diǎn)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域和內(nèi)切酶活性。另外，研究表明：Rep78與AAV ITR的直接接觸為三元復(fù)合物的形成所必需。Rep和ICP8在核復(fù)制區(qū)域的共區(qū)域化依賴于Rep與AAV ITR的結(jié)合和解開(kāi)ITR雙鏈能力。Rep78/68與AAV ITR的RBS結(jié)合，解開(kāi)AAV ITR的雙鏈，牽引ICP8、解旋酶與引物酶復(fù)合物以及其他的復(fù)制相關(guān)因子，然后ICP8迅速與ss-DNA區(qū)域結(jié)合。這兩個(gè)進(jìn)程是否有相互作用至今還無(wú)法確定。接下來(lái)由于蛋白與蛋白的相互作用，三元復(fù)合物得以形成。

3.2 AAV-2 Rep68蛋白的區(qū)域連接是寡聚化進(jìn)程的重要組成部分

AAV的4個(gè)Rep蛋白相互協(xié)調(diào)，共同作用于腺相關(guān)病毒生命周期的各個(gè)方面：包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA復(fù)制、病毒包裝及定點(diǎn)整合。所有的Rep蛋白都有一個(gè)SF3超家族解旋酶結(jié)構(gòu)域，在其他的SF3家族中，這一結(jié)構(gòu)域能有效地誘使寡聚化，然而依據(jù)AAV Rep蛋白單體的特性，發(fā)現(xiàn)AAV Rep蛋白中的解旋酶結(jié)構(gòu)域無(wú)法調(diào)節(jié)穩(wěn)定的寡聚化［31］。

Zarate-Perez等［31］推測(cè)存在一個(gè)未知的決定性結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)節(jié)Rep蛋白的寡聚化。通過(guò)比較AAV-2 Rep蛋白的解旋酶結(jié)構(gòu)域和其他的SF3家族的解旋酶結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，Rep蛋白解旋酶結(jié)構(gòu)域的小寡聚亞結(jié)構(gòu)存在一個(gè)主要結(jié)構(gòu)，與其他的SF3解旋酶結(jié)構(gòu)域有明顯的差異。此外，Rep蛋白的解旋酶結(jié)構(gòu)域和自身的起始結(jié)合區(qū)域（OBD）結(jié)合的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型表明有形成α-螺旋的潛力。其中，Rep蛋白的芳香族連接基團(tuán)（Y224）對(duì)寡聚化至關(guān)重要，它是SF3解旋酶的保守序列。這個(gè)基團(tuán)的突變明顯影響寡聚化作用，并且使產(chǎn)生感染性病毒的能力完全喪失?？傊梢约僭O(shè)一個(gè)寡聚化機(jī)制模型：在解旋酶結(jié)構(gòu)域折疊形成α-螺旋之前，Y224能夠成為解旋酶結(jié)構(gòu)域整體的一部分，對(duì)寡聚化至關(guān)重要，同時(shí)通過(guò)與OBD和解旋酶結(jié)構(gòu)域相互合作來(lái)對(duì)Rep68蛋白的功能發(fā)揮重要影響［31］。

AAV-2 Rep68蛋白的區(qū)域連接是它的寡聚化進(jìn)程的一部分，在寡聚化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用［31］。

4 Rep78/Rep68抑制病毒的生物活性以及對(duì)輔助病毒的依賴性

4.1 AAV Rep78限制腺病毒E1B55K調(diào)節(jié)的p53核輸出

p53是重要的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，可以抑制癌癥的發(fā)生［32］，參與細(xì)胞周期的循環(huán)，當(dāng)有嚴(yán)重的DNA損傷時(shí)能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡［33］。E1B55K蛋白是腺病毒的早期基因產(chǎn)物，能與p53的氨基末端轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合［34］，形成復(fù)合物，從而可以誘使p53從核內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，這樣就達(dá)到了抑制p53的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄效應(yīng)［35］。其中，E1B55K-p53的相互作用的發(fā)生依賴于E1B55K的寡聚化和p53的四聚體化［36］。而AAV能夠使p53不被腺病毒影響，這對(duì)癌癥的治療起著特殊的意義。研究表明：在腺病毒和AAV共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，Rep78和p53會(huì)形成復(fù)合物［37］，但是AAV如何影響E1B55K抑制p53相關(guān)活性的準(zhǔn)確機(jī)制還沒(méi)有弄清楚。Wang等［38］發(fā)現(xiàn)AAV-2的Rep78蛋白能抑制腺病毒5型E1B55K調(diào)節(jié)的p53核輸出這一進(jìn)程，但不能直接影響p53的穩(wěn)定性，也不能緩解對(duì)p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的抑制作用。

Wang等［38］通過(guò)共聚熒光分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Rep78、E1B55K和p53在H1299細(xì)胞中共表達(dá)時(shí)，Rep78會(huì)抑制E1B55K與p53的相互靠近，也能促使E1B55K重新定位。E1B55K具有E3 SUMO1-p53連接酶的功能，可以誘使p53與E1B55K在白血病基因核體（PML-NBs）處共區(qū)域化，從而使得p53的核輸出得以實(shí)現(xiàn)［39］。Rep78 也許能夠抑制p53共區(qū)域化后的核輸出，具體的機(jī)制還未弄清。

Rep78蛋白并沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)直接影響p53的降解和E1B55K的抑制作用。雖然Rep78也能與p53相結(jié)合，但是不能從p53-E1B55K復(fù)合物中取代E1B55K。Rep78能夠引導(dǎo)p53重新定位于核內(nèi)，但E1B55K依然與p53共區(qū)域化。因此，E1B55K 仍然和p53的氨基末端轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域結(jié)合，這也就解釋了雖然p53在核內(nèi)大量積累，但p53的穩(wěn)定性以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性沒(méi)有增加。也許，p53、E1B55K和Rep78共同表達(dá)時(shí)能形成三聚體復(fù)合物，E1B55K也可能與Rep78結(jié)合［13］。

雖然在E1B55K存在下，Rep78不直接影響p53的穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，但能使p53和E1B55K在核內(nèi)重定位。目前還不清楚是否有其他的作用影響這一過(guò)程。Rep78通過(guò)限制p53的核輸出來(lái)抑制腺病毒5型的作用這一新的機(jī)制，對(duì)我們研究腺病毒這一輔助病毒對(duì)AAV的調(diào)節(jié)有著重大意義［38］。

4.2 AAV Rep78和HPV E1相互作用，促使Rep78和ITR DNA結(jié)合

AAV 的相關(guān)生命活動(dòng)需要輔助病毒提供幫助，才能正常進(jìn)行［40］。如人乳頭瘤病毒16型（HPV）E1蛋白對(duì)AAV2的生命周期就可提供幫助，可以提高AAV DNA、mRNA，以及一些相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。與AAV Rep78類(lèi)似，E1是HPV的復(fù)制蛋白，但E1沒(méi)有Rep78的內(nèi)切酶和共價(jià)結(jié)合活性。E1和Rep78在體外可以相互作用，利用從細(xì)菌中提純的Rep78和E1蛋白，研究在體外E1蛋白對(duì)Rep78與AAV ITR DNA相互作用的影響。E1能夠增強(qiáng)Rep78-ITR的結(jié)合、ATP酶活、Rep78-ITR的共價(jià)連接以及Rep78-ITR的內(nèi)切酶活性，這種增強(qiáng)作用有明顯的劑量依賴關(guān)系。然而，E1和Rep78相互作用后的Rep78解旋酶活性明顯要比Rep78單獨(dú)時(shí)的解旋酶活性低。研究表明，E1之所以能對(duì)AAV的生命周期進(jìn)行廣泛的調(diào)節(jié)，是由于E1可以增強(qiáng)Rep78與ITR DNA結(jié)合至關(guān)重要的區(qū)域的生化特性［5］。

解旋酶活性改變不是E1蛋白誘發(fā)AAV更有效復(fù)制的直接機(jī)制，在HPV E1存在下，Rep-ITR復(fù)合物的相關(guān)功能增強(qiáng)，但是E1不能直接與ITR結(jié)合。E1蛋白能夠增強(qiáng)Rep78 在AAV ITR上的內(nèi)切酶活性和共價(jià)結(jié)合能力。因此，可能正是由于這個(gè)原因，E1蛋白才能促使Rep78和ITR的結(jié)合作用。E1可以增強(qiáng)Rep78在目標(biāo)DNA上形成寡聚物的能力，多樣的Rep78寡聚物與AAV ITR DNA相結(jié)合，其中ATP會(huì)促進(jìn)部分的寡聚物形成。而且，E1蛋白也能夠增強(qiáng)Rep78蛋白的ATP酶活性。ATP酶活性又會(huì)影響解旋酶、內(nèi)切酶活性以及共價(jià)結(jié)合?？傊ㄟ^(guò)增強(qiáng)Rep78的關(guān)鍵位點(diǎn)的生化特性，E1蛋白便可以促進(jìn)Rep78與ITR DNA的結(jié)合，進(jìn)而對(duì)AAV生命周期的相關(guān)進(jìn)程產(chǎn)生重要作用［5］。

4.3 AAV Rep78蛋白抑制乙型肝炎病毒（HBV）

AAV可以抑制人乳頭瘤病毒（HPV）、腺病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒和類(lèi)猿病毒SV40等，1989年首次報(bào)道將AAV抑制病毒的作用歸結(jié)于Rep78蛋白的作用。

劉天會(huì)等［41］利用PCR技術(shù)擴(kuò)增HBV-S、C和X基因。通過(guò)凝膠電泳阻滯試驗(yàn)（EMSA），可以檢測(cè)到Rep78蛋白在體外能夠與HBV-S、C和X的DNA相結(jié)合，并且與HBV-C的結(jié)合能力最強(qiáng)，還發(fā)現(xiàn)隨著Rep78 劑量增多，結(jié)合能力更強(qiáng)，呈一定的劑量依賴關(guān)系。劉天會(huì)等［41］研究表明AAV Rep78蛋白可與HBC-C啟動(dòng)子特異結(jié)合，從而下調(diào)其轉(zhuǎn)錄［42］。因此，可以推測(cè)AAV-Rep78抑制HBV DNA復(fù)制的機(jī)制就是Rep78蛋白結(jié)合并抑制了HBV-C基因，這為抗HBV提供了一些新思路，更重要的是可以改善rAAV載體在基因治療中的應(yīng)用。

5 展望

Rep78/68在腺相關(guān)病毒生命周期中有著很多重要的作用：Rep78/68蛋白的表達(dá)對(duì)AAV病毒從整合狀態(tài)的拯救、各種AAV基因的表達(dá)和AAV DNA的復(fù)制都是必需的。另外，Rep的表達(dá)能夠抑制腺病毒（Ad）、猿猴病毒40（SV40）、人乳頭瘤病毒（HPV）、艾滋病毒（HIV）和皰疹病毒的傳播。 Rep 78和Rep68蛋白與AAV基因表達(dá)的正負(fù)調(diào)控有關(guān)［4］?？傊?，Rep78和Rep68蛋白在AAV的生命周期中起著至關(guān)重要的作用，雖然我們對(duì)其中的一些作用的機(jī)理有了一定程度的認(rèn)識(shí)，但許多與Rep蛋白相關(guān)的作用的具體機(jī)制仍然還需探索。例如，Rep78/68對(duì)AAV DNA定點(diǎn)整合到人類(lèi)19號(hào)染色體作用的最合理、最準(zhǔn)確的機(jī)制還不是很清楚，Rep78抑制的p53-E1B55KHPV 共區(qū)域化后的p53核輸出的具體機(jī)制研究的也不是十分清楚，E1上調(diào)的 AAV Rep78蛋白調(diào)節(jié)復(fù)制能力的具體區(qū)域，以及具體的生化特性，以及Y224影響Rep蛋白寡聚化詳細(xì)機(jī)理。對(duì)Rep蛋白的深入研究有助于AAV的探究，可以促進(jìn)rAAV介導(dǎo)的基因治療的發(fā)展［43，44］，其意義深遠(yuǎn)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Progress in the Research Regarding to the Function of Protein Rep78/68

Zhan Shenbiao1Lü Yinghui1，2Li Zhaofa1，2
（1.Institute of Molecular Medicine，Huaqiao University，Quanzhou 362021；2.Molecular Medicine Engineering Research Center，Ministry of Education，Quanzhou 362021）

Rep78/68, a type of nonstructural proteins encoded by adeno-associated virus（AAV）genome, have a variety of control functions. Rep78/68 promote the integration of AAV DNA site-specific into human chromosome 19, suppress the virus biological activity, such as adenovirus, simian virus 40, adjust the AAV DNA replication and transcription, etc. This paper mainly discusses the mechanism of site-specific integration, the mechanism of Rep78 / AAV ITR/ICP8 complex formation and the characteristics of the oligomerization of Rep68 protein, the limit of the nuclear output of p53 by Rep78 protein, the interaction between AAV Rep78 and human papilloma virus（HPV）E1 protein prompt the combination of Rep78 and ITR DNA, inhibition of the hepatitis B virus（HBV）by Rep78. While the detailed mechanism still remaines to be improved and enriched, further elucidatation of Rep78/68 protein related mechanism may improve the production technology of rAAV and develop gene drug based on rAAV, which has a great significance.

AAV Rep78 Rep68 p53 Mechanism

2013-09-14

國(guó)家自然科學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目 （81201183），中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目 （JB-ZR1142）

占申標(biāo)，男，碩士研究生，研究方向：基因工程；E-mail：1200416004@hqu.edu.cn

李招發(fā)，男，博士，副研究員，研究方向：基因工程，生物醫(yī)學(xué)工程；E-mail：lizhaofa@hqu.edu.cn