張蕾　邢紹芝　張婷婷　趙磊磊

【摘要】 目的 研究分析甲胎蛋白對(duì)PTEN活性產(chǎn)生抑制引起肝癌細(xì)胞耐受ATRA發(fā)生凋亡。方法 選取2012年11月～2013年11月期間本院診治36例肝癌患者， 將患者術(shù)后肝癌細(xì)胞制成標(biāo)本。結(jié)果 人體肝癌HepG2與Bel 7402細(xì)胞均存在PTEN表達(dá)， 經(jīng)160 μmol/L的ATRA處理24 h后可加強(qiáng)這些細(xì)胞的PTEN的表達(dá)。Co-IP技術(shù)實(shí)驗(yàn)得知甲胎蛋白可與PTEN相結(jié)合， 最終對(duì)ATRA產(chǎn)生影響。結(jié)論 肝癌細(xì)胞中表達(dá)的甲胎蛋白可與PTEN相結(jié)合， 最終發(fā)現(xiàn)AFP為肝癌細(xì)胞耐受ATRA的重要因子。

【關(guān)鍵詞】 甲胎蛋白；PTEN活性；肝癌細(xì)胞；ATRA

肝癌是人類健康最大的威脅疾病中的一種， 因?yàn)槭艿讲《拘愿窝?、環(huán)境等有關(guān)因素的影響， 導(dǎo)致肝癌發(fā)病的機(jī)率逐漸升高。因?yàn)楦伟┘?xì)胞會(huì)出現(xiàn)再生、轉(zhuǎn)移， 同時(shí)癌細(xì)胞對(duì)藥物存在一定的耐受， 從而增加了治療難度。因此， 充分掌握肝癌耐藥因子的機(jī)制， 對(duì)臨床肝癌的治療十分重要。甲胎蛋白（簡稱AFP）是肝癌細(xì)胞合成的具有很高特異性的蛋白質(zhì)之一， 絕大多數(shù)肝癌患者在發(fā)病期會(huì)產(chǎn)生AFP基因高表達(dá)的特點(diǎn)， 并且AFP是肝癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。有資料指出， 肝癌細(xì)胞產(chǎn)生的AFP能加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的雙重作用。PTEN則是將3-磷酸肌醇（簡稱PIP3）水解成2-磷酸肌醇（簡稱PIP2）的磷酸酶， 同時(shí)可以避免3-磷酸肌醇激酶（簡稱PI3K）磷酸化蛋白激酶B（簡稱PKB/AKT）， 導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)被中斷， 可見是一種非常關(guān)鍵的抑癌基因。AFP的生物學(xué)性質(zhì)可能還存在對(duì)ATRA抗凋亡產(chǎn)生誘導(dǎo)作用， 但是肝癌細(xì)胞合成的AFP在機(jī)體中肝癌細(xì)胞耐受凋亡過程具體發(fā)揮的作用報(bào)道較少， 現(xiàn)本次研究進(jìn)一步探討AFP在人體肝癌細(xì)胞中對(duì)PTEN活性產(chǎn)生的影響， 總結(jié)如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2012年11月～2013年11月期間本院診治36例肝癌患者， 并在患者術(shù)后肝癌組織中提取HLE、HepG2、Bel 7402細(xì)胞加以培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)材料：ser 473多克隆抗體、兔抗人AKT/PKB多克隆抗體、小鼠抗人AFP 單克隆抗體均源自PS公司。Β-Actin單克隆抗體及魯米諾試劑源自SC公司。兔抗人PTEN多克隆抗體由美國實(shí)驗(yàn)室視覺公司生產(chǎn)。二抗是羊抗兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶連接的羊抗鼠。FITC標(biāo)記的羊抗兔與TRITC標(biāo)記的羊抗小鼠二抗由美國杰克遜IR公司生產(chǎn)。RNA干擾試劑盒， 即癌/ GFP / Neo si-RNA表達(dá)載體試劑盒由上海吉瑪公司提供。Ly294002及ATRA由Sigma提供。pcDNA3.1載體源自廣州泰盛公司。

1. 2 方法 應(yīng)用Western blotting法對(duì)全反式維甲酸（簡稱ATRA）進(jìn)行分析并處理人體肝癌HepG2、Bel 7402細(xì)胞24 h后， PTEN表達(dá)產(chǎn)生變化的情況[2]。通過免疫共沉淀（簡稱Co-IP）技術(shù)分析PTEN與AFP之間相互作用。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測PTEN與AFP在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況。通過RNA干擾（即指RNAi）技術(shù)對(duì)AFP的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用， 然后采用ATRA處理24 h后， 檢測細(xì)胞中PTEN表達(dá)發(fā)生變化的情況， 同時(shí)研究蛋白激酶B（簡稱AKT）的磷酸化程度。再利用pcDNA3.1質(zhì)粒、人體afp基因連接組成表達(dá)AFP的載體（簡稱pcDNA3.1-afp）， 最后轉(zhuǎn)染成不表達(dá)AFP的人體肝癌HLE細(xì)胞。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0對(duì)組間試驗(yàn)研究數(shù)據(jù)加以統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 應(yīng)用t法對(duì)組間計(jì)量資料進(jìn)行檢驗(yàn)， 應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)組間計(jì)數(shù)資料進(jìn)行檢驗(yàn)。如若對(duì)比差異P<0.05， 則充分表明組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

人體肝癌HepG2、Bel 7402細(xì)胞均存在PTEN的表達(dá)， 通過160 μmol/L濃度的ATRT處理24 h后可加強(qiáng)這些肝癌細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá)。經(jīng)Co-IP技術(shù)實(shí)驗(yàn)可知AFP可與PTEN相結(jié)合。采用共聚焦纖維鏡監(jiān)測發(fā)現(xiàn)PTEN與AFP之間共定位在細(xì)胞漿。在干擾AFP表達(dá)以后， 發(fā)現(xiàn)PTEN表達(dá)顯著升高， 表達(dá)前后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而抑制AFP表達(dá)以后，ATRA可明顯增強(qiáng)Bel 7402細(xì)胞中PTEN的表達(dá)， 同時(shí)可以使AKT磷酸化受到抑制。當(dāng)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-afp載體以后， 肝癌HLE細(xì)胞中存在AFP表達(dá)， 同時(shí)能和PTEN相結(jié)合， 由此可知pcDNA3.1-afp載體可以促進(jìn)AKT磷酸化（即為p-AKT）， 從而對(duì)抗ATRA使HLE細(xì)胞增殖受到抑制。詳見表1、圖1～3。

3 討論

肝癌細(xì)胞中出現(xiàn)AFP高表達(dá)的現(xiàn)象， 可能與癌細(xì)胞在體內(nèi)過度的生殖、轉(zhuǎn)移以及侵襲存在很大關(guān)系。有資料指出使AFP表達(dá)被抑制， 可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞逐漸凋亡。AFP同細(xì)胞中的部分信息物質(zhì)相互結(jié)合， 進(jìn)而對(duì)凋亡信息的傳導(dǎo)產(chǎn)生影響。其中， AKT、PTEN以及AFP表達(dá)的檢測， 能分析出AFP與AKT磷酸化、PTEN功能之間的關(guān)系[3， 4]。本次研究得出人體肝癌HepG2、Bel 7402細(xì)胞、HLE內(nèi)均存在PTEN表達(dá)。但HepG2、Bel 7402細(xì)胞高表達(dá)AFP， HLE細(xì)胞則不表達(dá)AFP。AKT為肝癌細(xì)胞傳遞、生長信號(hào)的重要因子， 在癌細(xì)胞生長期間起到中心信息物質(zhì)的作用， 所以AKT活化程度說明癌細(xì)胞生長旺盛。本次研究得出， 人體內(nèi)肝癌Bel 7402細(xì)胞由于受到ATRA作用， 以至于PTEN表達(dá)明顯提高， 由此得知PTEN基因可以在肝癌細(xì)胞內(nèi)有效被激活。通過免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生的AFP能夠與PTEN相互結(jié)合， 組合成復(fù)合體。進(jìn)一步表明PTEN與AFP之間具有相互作用的可能。利用共聚焦纖維鏡監(jiān)測Bel 7402細(xì)胞內(nèi)的PTEN、AFP可見， 其多分布在細(xì)胞漿內(nèi)， 僅有一小部分PTEN蛋白分布在細(xì)胞核中， 由此表明PTEN蛋白與AFP在細(xì)胞漿內(nèi)能夠出現(xiàn)共定位現(xiàn)象。

AFP可通過下面兩種途徑對(duì)PTEN磷酸化作用造成抑制[5， 6]：①AFP可抑制PTEN表達(dá)， 以利于降低PTEN水解生成PIP3。②AFP能夠與PTEN相互結(jié)合， 利用兩者之間的互相作用， 對(duì)PTEN磷酸酶活性產(chǎn)生抑制， 使AFP能夠最快速度的使PI3K/AKT信號(hào)被激活?？梢夾FP對(duì)PI3K/AKT信號(hào)激活的過程， 考慮是AFP強(qiáng)化癌細(xì)胞生殖、轉(zhuǎn)移以及侵襲的主要機(jī)制[7]。AFP的生物學(xué)性質(zhì)能夠?qū)π畔⒎肿訕赢a(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。因?yàn)镻TEN正常表達(dá)情況下， 可以增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性， 可見靶向干擾AFP表達(dá)能有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡， 并且抑制AFP強(qiáng)化癌細(xì)胞生長的新的有效策略。

參考文獻(xiàn)

[1] 朱明月，符史干，李孟森，等.甲胎蛋白抑制 PTEN 活性導(dǎo)致肝癌細(xì)胞耐受 ATRA 誘導(dǎo)的凋亡.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2011， 38（3）：227-238.

[2] 米登海.PTEN與VEGF在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及相互作用.華中科技大學(xué)， 2010，12（20）：132-133.

[3] 王麗.抑癌基因PTEN在肝癌組織中的表達(dá)及HCV核心蛋白對(duì)PTEN作用的研究.第四軍醫(yī)大學(xué)， 2010，12（10）：455-456.

[4] 姚悅萍，王娟華，陸忠華，等.血清甲胎蛋白異質(zhì)體對(duì)肝細(xì)胞癌的診斷意義.實(shí)用肝臟病雜志， 2011，23（4）：541-542.

[5] 陳偉.抑癌基因PTEN、p27在肝細(xì)胞性肝癌組織中的表達(dá)及臨床相關(guān)性研究.安徽醫(yī)科大學(xué)， 2010，23（13）：557-559.

[6] 沈慧.原發(fā)性肝癌中PTEN蛋白表達(dá)及其與HBV感染的關(guān)系.山西醫(yī)科大學(xué)， 2010，22（11）：821-825.

[7] 秦敏. PTEN、p-Akt在白藜蘆醇抑制人肝癌細(xì)胞增殖與促進(jìn)其凋亡中的作用.河北醫(yī)科大學(xué)， 2010，14（10）：451-453.

【摘要】 目的 研究分析甲胎蛋白對(duì)PTEN活性產(chǎn)生抑制引起肝癌細(xì)胞耐受ATRA發(fā)生凋亡。方法 選取2012年11月～2013年11月期間本院診治36例肝癌患者， 將患者術(shù)后肝癌細(xì)胞制成標(biāo)本。結(jié)果 人體肝癌HepG2與Bel 7402細(xì)胞均存在PTEN表達(dá)， 經(jīng)160 μmol/L的ATRA處理24 h后可加強(qiáng)這些細(xì)胞的PTEN的表達(dá)。Co-IP技術(shù)實(shí)驗(yàn)得知甲胎蛋白可與PTEN相結(jié)合， 最終對(duì)ATRA產(chǎn)生影響。結(jié)論 肝癌細(xì)胞中表達(dá)的甲胎蛋白可與PTEN相結(jié)合， 最終發(fā)現(xiàn)AFP為肝癌細(xì)胞耐受ATRA的重要因子。

【關(guān)鍵詞】 甲胎蛋白；PTEN活性；肝癌細(xì)胞；ATRA

肝癌是人類健康最大的威脅疾病中的一種， 因?yàn)槭艿讲《拘愿窝?、環(huán)境等有關(guān)因素的影響， 導(dǎo)致肝癌發(fā)病的機(jī)率逐漸升高。因?yàn)楦伟┘?xì)胞會(huì)出現(xiàn)再生、轉(zhuǎn)移， 同時(shí)癌細(xì)胞對(duì)藥物存在一定的耐受， 從而增加了治療難度。因此， 充分掌握肝癌耐藥因子的機(jī)制， 對(duì)臨床肝癌的治療十分重要。甲胎蛋白（簡稱AFP）是肝癌細(xì)胞合成的具有很高特異性的蛋白質(zhì)之一， 絕大多數(shù)肝癌患者在發(fā)病期會(huì)產(chǎn)生AFP基因高表達(dá)的特點(diǎn)， 并且AFP是肝癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。有資料指出， 肝癌細(xì)胞產(chǎn)生的AFP能加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的雙重作用。PTEN則是將3-磷酸肌醇（簡稱PIP3）水解成2-磷酸肌醇（簡稱PIP2）的磷酸酶， 同時(shí)可以避免3-磷酸肌醇激酶（簡稱PI3K）磷酸化蛋白激酶B（簡稱PKB/AKT）， 導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)被中斷， 可見是一種非常關(guān)鍵的抑癌基因。AFP的生物學(xué)性質(zhì)可能還存在對(duì)ATRA抗凋亡產(chǎn)生誘導(dǎo)作用， 但是肝癌細(xì)胞合成的AFP在機(jī)體中肝癌細(xì)胞耐受凋亡過程具體發(fā)揮的作用報(bào)道較少， 現(xiàn)本次研究進(jìn)一步探討AFP在人體肝癌細(xì)胞中對(duì)PTEN活性產(chǎn)生的影響， 總結(jié)如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2012年11月～2013年11月期間本院診治36例肝癌患者， 并在患者術(shù)后肝癌組織中提取HLE、HepG2、Bel 7402細(xì)胞加以培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)材料：ser 473多克隆抗體、兔抗人AKT/PKB多克隆抗體、小鼠抗人AFP 單克隆抗體均源自PS公司。Β-Actin單克隆抗體及魯米諾試劑源自SC公司。兔抗人PTEN多克隆抗體由美國實(shí)驗(yàn)室視覺公司生產(chǎn)。二抗是羊抗兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶連接的羊抗鼠。FITC標(biāo)記的羊抗兔與TRITC標(biāo)記的羊抗小鼠二抗由美國杰克遜IR公司生產(chǎn)。RNA干擾試劑盒， 即癌/ GFP / Neo si-RNA表達(dá)載體試劑盒由上海吉瑪公司提供。Ly294002及ATRA由Sigma提供。pcDNA3.1載體源自廣州泰盛公司。

1. 2 方法 應(yīng)用Western blotting法對(duì)全反式維甲酸（簡稱ATRA）進(jìn)行分析并處理人體肝癌HepG2、Bel 7402細(xì)胞24 h后， PTEN表達(dá)產(chǎn)生變化的情況[2]。通過免疫共沉淀（簡稱Co-IP）技術(shù)分析PTEN與AFP之間相互作用。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測PTEN與AFP在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況。通過RNA干擾（即指RNAi）技術(shù)對(duì)AFP的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用， 然后采用ATRA處理24 h后， 檢測細(xì)胞中PTEN表達(dá)發(fā)生變化的情況， 同時(shí)研究蛋白激酶B（簡稱AKT）的磷酸化程度。再利用pcDNA3.1質(zhì)粒、人體afp基因連接組成表達(dá)AFP的載體（簡稱pcDNA3.1-afp）， 最后轉(zhuǎn)染成不表達(dá)AFP的人體肝癌HLE細(xì)胞。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0對(duì)組間試驗(yàn)研究數(shù)據(jù)加以統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 應(yīng)用t法對(duì)組間計(jì)量資料進(jìn)行檢驗(yàn)， 應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)組間計(jì)數(shù)資料進(jìn)行檢驗(yàn)。如若對(duì)比差異P<0.05， 則充分表明組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

人體肝癌HepG2、Bel 7402細(xì)胞均存在PTEN的表達(dá)， 通過160 μmol/L濃度的ATRT處理24 h后可加強(qiáng)這些肝癌細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá)。經(jīng)Co-IP技術(shù)實(shí)驗(yàn)可知AFP可與PTEN相結(jié)合。采用共聚焦纖維鏡監(jiān)測發(fā)現(xiàn)PTEN與AFP之間共定位在細(xì)胞漿。在干擾AFP表達(dá)以后， 發(fā)現(xiàn)PTEN表達(dá)顯著升高， 表達(dá)前后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而抑制AFP表達(dá)以后，ATRA可明顯增強(qiáng)Bel 7402細(xì)胞中PTEN的表達(dá)， 同時(shí)可以使AKT磷酸化受到抑制。當(dāng)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-afp載體以后， 肝癌HLE細(xì)胞中存在AFP表達(dá)， 同時(shí)能和PTEN相結(jié)合， 由此可知pcDNA3.1-afp載體可以促進(jìn)AKT磷酸化（即為p-AKT）， 從而對(duì)抗ATRA使HLE細(xì)胞增殖受到抑制。詳見表1、圖1～3。

3 討論

肝癌細(xì)胞中出現(xiàn)AFP高表達(dá)的現(xiàn)象， 可能與癌細(xì)胞在體內(nèi)過度的生殖、轉(zhuǎn)移以及侵襲存在很大關(guān)系。有資料指出使AFP表達(dá)被抑制， 可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞逐漸凋亡。AFP同細(xì)胞中的部分信息物質(zhì)相互結(jié)合， 進(jìn)而對(duì)凋亡信息的傳導(dǎo)產(chǎn)生影響。其中， AKT、PTEN以及AFP表達(dá)的檢測， 能分析出AFP與AKT磷酸化、PTEN功能之間的關(guān)系[3， 4]。本次研究得出人體肝癌HepG2、Bel 7402細(xì)胞、HLE內(nèi)均存在PTEN表達(dá)。但HepG2、Bel 7402細(xì)胞高表達(dá)AFP， HLE細(xì)胞則不表達(dá)AFP。AKT為肝癌細(xì)胞傳遞、生長信號(hào)的重要因子， 在癌細(xì)胞生長期間起到中心信息物質(zhì)的作用， 所以AKT活化程度說明癌細(xì)胞生長旺盛。本次研究得出， 人體內(nèi)肝癌Bel 7402細(xì)胞由于受到ATRA作用， 以至于PTEN表達(dá)明顯提高， 由此得知PTEN基因可以在肝癌細(xì)胞內(nèi)有效被激活。通過免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生的AFP能夠與PTEN相互結(jié)合， 組合成復(fù)合體。進(jìn)一步表明PTEN與AFP之間具有相互作用的可能。利用共聚焦纖維鏡監(jiān)測Bel 7402細(xì)胞內(nèi)的PTEN、AFP可見， 其多分布在細(xì)胞漿內(nèi)， 僅有一小部分PTEN蛋白分布在細(xì)胞核中， 由此表明PTEN蛋白與AFP在細(xì)胞漿內(nèi)能夠出現(xiàn)共定位現(xiàn)象。

AFP可通過下面兩種途徑對(duì)PTEN磷酸化作用造成抑制[5， 6]：①AFP可抑制PTEN表達(dá)， 以利于降低PTEN水解生成PIP3。②AFP能夠與PTEN相互結(jié)合， 利用兩者之間的互相作用， 對(duì)PTEN磷酸酶活性產(chǎn)生抑制， 使AFP能夠最快速度的使PI3K/AKT信號(hào)被激活?？梢夾FP對(duì)PI3K/AKT信號(hào)激活的過程， 考慮是AFP強(qiáng)化癌細(xì)胞生殖、轉(zhuǎn)移以及侵襲的主要機(jī)制[7]。AFP的生物學(xué)性質(zhì)能夠?qū)π畔⒎肿訕赢a(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。因?yàn)镻TEN正常表達(dá)情況下， 可以增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性， 可見靶向干擾AFP表達(dá)能有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡， 并且抑制AFP強(qiáng)化癌細(xì)胞生長的新的有效策略。

參考文獻(xiàn)

[1] 朱明月，符史干，李孟森，等.甲胎蛋白抑制 PTEN 活性導(dǎo)致肝癌細(xì)胞耐受 ATRA 誘導(dǎo)的凋亡.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2011， 38（3）：227-238.

[2] 米登海.PTEN與VEGF在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及相互作用.華中科技大學(xué)， 2010，12（20）：132-133.

[3] 王麗.抑癌基因PTEN在肝癌組織中的表達(dá)及HCV核心蛋白對(duì)PTEN作用的研究.第四軍醫(yī)大學(xué)， 2010，12（10）：455-456.

[4] 姚悅萍，王娟華，陸忠華，等.血清甲胎蛋白異質(zhì)體對(duì)肝細(xì)胞癌的診斷意義.實(shí)用肝臟病雜志， 2011，23（4）：541-542.

[5] 陳偉.抑癌基因PTEN、p27在肝細(xì)胞性肝癌組織中的表達(dá)及臨床相關(guān)性研究.安徽醫(yī)科大學(xué)， 2010，23（13）：557-559.

[6] 沈慧.原發(fā)性肝癌中PTEN蛋白表達(dá)及其與HBV感染的關(guān)系.山西醫(yī)科大學(xué)， 2010，22（11）：821-825.

[7] 秦敏. PTEN、p-Akt在白藜蘆醇抑制人肝癌細(xì)胞增殖與促進(jìn)其凋亡中的作用.河北醫(yī)科大學(xué)， 2010，14（10）：451-453.

【摘要】 目的 研究分析甲胎蛋白對(duì)PTEN活性產(chǎn)生抑制引起肝癌細(xì)胞耐受ATRA發(fā)生凋亡。方法 選取2012年11月～2013年11月期間本院診治36例肝癌患者， 將患者術(shù)后肝癌細(xì)胞制成標(biāo)本。結(jié)果 人體肝癌HepG2與Bel 7402細(xì)胞均存在PTEN表達(dá)， 經(jīng)160 μmol/L的ATRA處理24 h后可加強(qiáng)這些細(xì)胞的PTEN的表達(dá)。Co-IP技術(shù)實(shí)驗(yàn)得知甲胎蛋白可與PTEN相結(jié)合， 最終對(duì)ATRA產(chǎn)生影響。結(jié)論 肝癌細(xì)胞中表達(dá)的甲胎蛋白可與PTEN相結(jié)合， 最終發(fā)現(xiàn)AFP為肝癌細(xì)胞耐受ATRA的重要因子。

【關(guān)鍵詞】 甲胎蛋白；PTEN活性；肝癌細(xì)胞；ATRA

肝癌是人類健康最大的威脅疾病中的一種， 因?yàn)槭艿讲《拘愿窝?、環(huán)境等有關(guān)因素的影響， 導(dǎo)致肝癌發(fā)病的機(jī)率逐漸升高。因?yàn)楦伟┘?xì)胞會(huì)出現(xiàn)再生、轉(zhuǎn)移， 同時(shí)癌細(xì)胞對(duì)藥物存在一定的耐受， 從而增加了治療難度。因此， 充分掌握肝癌耐藥因子的機(jī)制， 對(duì)臨床肝癌的治療十分重要。甲胎蛋白（簡稱AFP）是肝癌細(xì)胞合成的具有很高特異性的蛋白質(zhì)之一， 絕大多數(shù)肝癌患者在發(fā)病期會(huì)產(chǎn)生AFP基因高表達(dá)的特點(diǎn)， 并且AFP是肝癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。有資料指出， 肝癌細(xì)胞產(chǎn)生的AFP能加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的雙重作用。PTEN則是將3-磷酸肌醇（簡稱PIP3）水解成2-磷酸肌醇（簡稱PIP2）的磷酸酶， 同時(shí)可以避免3-磷酸肌醇激酶（簡稱PI3K）磷酸化蛋白激酶B（簡稱PKB/AKT）， 導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)被中斷， 可見是一種非常關(guān)鍵的抑癌基因。AFP的生物學(xué)性質(zhì)可能還存在對(duì)ATRA抗凋亡產(chǎn)生誘導(dǎo)作用， 但是肝癌細(xì)胞合成的AFP在機(jī)體中肝癌細(xì)胞耐受凋亡過程具體發(fā)揮的作用報(bào)道較少， 現(xiàn)本次研究進(jìn)一步探討AFP在人體肝癌細(xì)胞中對(duì)PTEN活性產(chǎn)生的影響， 總結(jié)如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2012年11月～2013年11月期間本院診治36例肝癌患者， 并在患者術(shù)后肝癌組織中提取HLE、HepG2、Bel 7402細(xì)胞加以培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)材料：ser 473多克隆抗體、兔抗人AKT/PKB多克隆抗體、小鼠抗人AFP 單克隆抗體均源自PS公司。Β-Actin單克隆抗體及魯米諾試劑源自SC公司。兔抗人PTEN多克隆抗體由美國實(shí)驗(yàn)室視覺公司生產(chǎn)。二抗是羊抗兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶連接的羊抗鼠。FITC標(biāo)記的羊抗兔與TRITC標(biāo)記的羊抗小鼠二抗由美國杰克遜IR公司生產(chǎn)。RNA干擾試劑盒， 即癌/ GFP / Neo si-RNA表達(dá)載體試劑盒由上海吉瑪公司提供。Ly294002及ATRA由Sigma提供。pcDNA3.1載體源自廣州泰盛公司。

1. 2 方法 應(yīng)用Western blotting法對(duì)全反式維甲酸（簡稱ATRA）進(jìn)行分析并處理人體肝癌HepG2、Bel 7402細(xì)胞24 h后， PTEN表達(dá)產(chǎn)生變化的情況[2]。通過免疫共沉淀（簡稱Co-IP）技術(shù)分析PTEN與AFP之間相互作用。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測PTEN與AFP在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況。通過RNA干擾（即指RNAi）技術(shù)對(duì)AFP的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用， 然后采用ATRA處理24 h后， 檢測細(xì)胞中PTEN表達(dá)發(fā)生變化的情況， 同時(shí)研究蛋白激酶B（簡稱AKT）的磷酸化程度。再利用pcDNA3.1質(zhì)粒、人體afp基因連接組成表達(dá)AFP的載體（簡稱pcDNA3.1-afp）， 最后轉(zhuǎn)染成不表達(dá)AFP的人體肝癌HLE細(xì)胞。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0對(duì)組間試驗(yàn)研究數(shù)據(jù)加以統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 應(yīng)用t法對(duì)組間計(jì)量資料進(jìn)行檢驗(yàn)， 應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)組間計(jì)數(shù)資料進(jìn)行檢驗(yàn)。如若對(duì)比差異P<0.05， 則充分表明組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

人體肝癌HepG2、Bel 7402細(xì)胞均存在PTEN的表達(dá)， 通過160 μmol/L濃度的ATRT處理24 h后可加強(qiáng)這些肝癌細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá)。經(jīng)Co-IP技術(shù)實(shí)驗(yàn)可知AFP可與PTEN相結(jié)合。采用共聚焦纖維鏡監(jiān)測發(fā)現(xiàn)PTEN與AFP之間共定位在細(xì)胞漿。在干擾AFP表達(dá)以后， 發(fā)現(xiàn)PTEN表達(dá)顯著升高， 表達(dá)前后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而抑制AFP表達(dá)以后，ATRA可明顯增強(qiáng)Bel 7402細(xì)胞中PTEN的表達(dá)， 同時(shí)可以使AKT磷酸化受到抑制。當(dāng)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-afp載體以后， 肝癌HLE細(xì)胞中存在AFP表達(dá)， 同時(shí)能和PTEN相結(jié)合， 由此可知pcDNA3.1-afp載體可以促進(jìn)AKT磷酸化（即為p-AKT）， 從而對(duì)抗ATRA使HLE細(xì)胞增殖受到抑制。詳見表1、圖1～3。

3 討論

肝癌細(xì)胞中出現(xiàn)AFP高表達(dá)的現(xiàn)象， 可能與癌細(xì)胞在體內(nèi)過度的生殖、轉(zhuǎn)移以及侵襲存在很大關(guān)系。有資料指出使AFP表達(dá)被抑制， 可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞逐漸凋亡。AFP同細(xì)胞中的部分信息物質(zhì)相互結(jié)合， 進(jìn)而對(duì)凋亡信息的傳導(dǎo)產(chǎn)生影響。其中， AKT、PTEN以及AFP表達(dá)的檢測， 能分析出AFP與AKT磷酸化、PTEN功能之間的關(guān)系[3， 4]。本次研究得出人體肝癌HepG2、Bel 7402細(xì)胞、HLE內(nèi)均存在PTEN表達(dá)。但HepG2、Bel 7402細(xì)胞高表達(dá)AFP， HLE細(xì)胞則不表達(dá)AFP。AKT為肝癌細(xì)胞傳遞、生長信號(hào)的重要因子， 在癌細(xì)胞生長期間起到中心信息物質(zhì)的作用， 所以AKT活化程度說明癌細(xì)胞生長旺盛。本次研究得出， 人體內(nèi)肝癌Bel 7402細(xì)胞由于受到ATRA作用， 以至于PTEN表達(dá)明顯提高， 由此得知PTEN基因可以在肝癌細(xì)胞內(nèi)有效被激活。通過免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生的AFP能夠與PTEN相互結(jié)合， 組合成復(fù)合體。進(jìn)一步表明PTEN與AFP之間具有相互作用的可能。利用共聚焦纖維鏡監(jiān)測Bel 7402細(xì)胞內(nèi)的PTEN、AFP可見， 其多分布在細(xì)胞漿內(nèi)， 僅有一小部分PTEN蛋白分布在細(xì)胞核中， 由此表明PTEN蛋白與AFP在細(xì)胞漿內(nèi)能夠出現(xiàn)共定位現(xiàn)象。

AFP可通過下面兩種途徑對(duì)PTEN磷酸化作用造成抑制[5， 6]：①AFP可抑制PTEN表達(dá)， 以利于降低PTEN水解生成PIP3。②AFP能夠與PTEN相互結(jié)合， 利用兩者之間的互相作用， 對(duì)PTEN磷酸酶活性產(chǎn)生抑制， 使AFP能夠最快速度的使PI3K/AKT信號(hào)被激活?？梢夾FP對(duì)PI3K/AKT信號(hào)激活的過程， 考慮是AFP強(qiáng)化癌細(xì)胞生殖、轉(zhuǎn)移以及侵襲的主要機(jī)制[7]。AFP的生物學(xué)性質(zhì)能夠?qū)π畔⒎肿訕赢a(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。因?yàn)镻TEN正常表達(dá)情況下， 可以增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性， 可見靶向干擾AFP表達(dá)能有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡， 并且抑制AFP強(qiáng)化癌細(xì)胞生長的新的有效策略。

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