張香敏，張展，程秀永，徐發(fā)林，賈天明，欒斌，賈莉婷

圍生期缺氧導(dǎo)致的新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic ischaemic brain damage，HIBD)是新生兒科的常見(jiàn)病和多發(fā)病，發(fā)病重，病死率高。近年來(lái)，隨著新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房的建立，死亡率較前降低，但重度窒息新生兒存活者中神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥如智力障礙、神經(jīng)行為問(wèn)題、腦性癱瘓等發(fā)生率較前上升，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)，是值得關(guān)注的社會(huì)問(wèn)題，也是目前廣大兒科醫(yī)務(wù)人員研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

有研究證實(shí)，肌肽對(duì)缺血性腦損傷、缺血再灌注性腦損傷等具有神經(jīng)保護(hù)作用[1-3]，但肌肽是否對(duì)缺氧缺血(hypoxic ischaemic，HI)性腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，目前未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在對(duì)7日齡大鼠制作HI模型，通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，探討肌肽對(duì)HI大鼠認(rèn)知功能的影響，從而推斷肌肽是否對(duì)HI大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7日齡清潔級(jí)SD大鼠(證書編號(hào)：SCXK(滬)2008-0016)，雌雄不拘，體質(zhì)量12～18 g，均購(gòu)自中科院實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)室，并經(jīng)復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)保護(hù)條例進(jìn)行，在研究期間新生大鼠與母鼠在同一籠內(nèi)飼養(yǎng)，光照時(shí)間12 h，自由攝食水。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 將36只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組,每組12只,(1)肌肽預(yù)處理組：在HI誘導(dǎo)前30 min腹腔注射肌肽1次250 mg/kg[4，5]；(2)HI組：在相同條件下用等容積的生理鹽水代替；(3)假手術(shù)組：不接受任何治療和處理。

1.2.2 HI模型制作 在室溫(25±2)℃環(huán)境下，將大鼠四肢及頭部固定在手術(shù)臺(tái)上，吸入無(wú)水乙醚誘導(dǎo)麻醉；皮膚常規(guī)消毒后小心剪開頸部皮膚，逐層分離暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈并小心分離迷走神經(jīng)，用4個(gè)0號(hào)外科絲線雙線結(jié)扎該動(dòng)脈并從中間剪斷，造成永久性斷流。此后將大鼠放回到母鼠身邊恢復(fù)1.5 h，氧氮混合氣體(8%氧氣/92%氮?dú)?缺氧箱中持續(xù)通入濕化的氮氧混合氣2 h，缺氧結(jié)束即制成7日齡大鼠HI腦損傷動(dòng)物模型。假手術(shù)組動(dòng)物與HI組動(dòng)物來(lái)自同一窩動(dòng)物，動(dòng)物置于相同條件下，既不結(jié)扎血管阻斷血流，也不置于缺氧箱里缺氧，皮膚切一小口，僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈。建模完成后動(dòng)物放回母鼠籠內(nèi)，并送回動(dòng)物房，由專人飼養(yǎng)。

1.2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)步驟 大鼠28～33 d時(shí)通過(guò)Morris水迷宮測(cè)試系統(tǒng)評(píng)價(jià)其空間學(xué)習(xí)和記憶能力，參考以前的方法并作小的修改[6]。每日9：00～16：00進(jìn)行，以盡量保證實(shí)驗(yàn)條件的均衡。(1)Morris水迷宮系統(tǒng)：本系統(tǒng)包括一個(gè)盛有水的黑色圓形水池(水池的直徑1.8 m，深度65 cm，水深27.5 cm，水溫(25±2)℃左右)，為了突出水中的目標(biāo)，水用墨汁染黑，以便于攝相機(jī)的跟蹤。池中隱藏在水下2 cm的半透明的站臺(tái)一個(gè)(10 cm×10 cm)；一套圖像采集與處理系統(tǒng)(攝像機(jī)、錄像機(jī)、顯示器和分析軟件等)。所有實(shí)驗(yàn)均在一安靜的屏蔽室內(nèi)進(jìn)行，為了避免可能利用的視覺(jué)提示，水池周圍的白色窗簾在實(shí)驗(yàn)時(shí)被放下。正式實(shí)驗(yàn)的前一天讓動(dòng)物在撤離平臺(tái)的水池內(nèi)適應(yīng)性訓(xùn)練1次，實(shí)驗(yàn)者不了解大鼠的分組情況。(2)經(jīng)典的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分。定位航行實(shí)驗(yàn)：歷時(shí)5 d，每次將大鼠面向池壁分別從4個(gè)不同象限的入水點(diǎn)放入水中，記錄其尋找到隱藏在水面下站臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期和找到站臺(tái)前游泳的距離以及游泳的速度，每次120 s。如果大鼠在規(guī)定時(shí)間內(nèi)不能找到站臺(tái)，測(cè)試者直接把大鼠放到站臺(tái)上停留30 s，以加強(qiáng)大鼠的記憶。然后以同樣的方法再測(cè)試下一只大鼠。每次訓(xùn)練間隔1 min?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：在定位航行試驗(yàn)結(jié)束后的次日(第6天)撤去平臺(tái)，然后選擇離站臺(tái)最遠(yuǎn)的入水點(diǎn)將大鼠面對(duì)池壁放入水池中。記錄其在一定時(shí)間內(nèi)的游泳軌跡，考察大鼠對(duì)隱藏站臺(tái)位置的記憶情況。測(cè)試時(shí)間為30 s。記錄其在目標(biāo)象限停留時(shí)間的百分比，此參數(shù)是空間記憶的特別測(cè)試。連接到水池正上方的計(jì)算機(jī)跟蹤軟件記錄實(shí)驗(yàn)的全過(guò)程。實(shí)驗(yàn)參數(shù)包括：大鼠的游泳時(shí)間、游泳距離及在目標(biāo)象限游泳時(shí)間的百分比。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠在Morris水迷宮定位導(dǎo)航測(cè)試中游泳時(shí)間和距離的比較 見(jiàn)表1、2。

表1 各組大鼠在Morris水迷宮定位導(dǎo)航測(cè)試中游泳時(shí)間的比較

注：與HI組比較,aP<0.05。

表2 各組大鼠在Morris水迷宮定位導(dǎo)航測(cè)試中游泳距離的比較

注：與HI組比較,aP<0.05。

在評(píng)價(jià)與大鼠學(xué)習(xí)能力有關(guān)的Morris水迷宮定位導(dǎo)航測(cè)試中，HI組動(dòng)物的游泳時(shí)間明顯大于肌肽預(yù)處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其游泳距離亦相應(yīng)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肌肽預(yù)處理組較HI組減少了HI動(dòng)物的游泳時(shí)間及距離，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而游泳時(shí)間和游泳距離在肌肽預(yù)處理組和假手術(shù)組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；此外，肌肽預(yù)處理后各組動(dòng)物游泳速度之間的差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 肌肽預(yù)處理對(duì)大鼠在目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比的影響 在評(píng)價(jià)與大鼠記憶能力有關(guān)的Morris水迷宮探索實(shí)驗(yàn)中，預(yù)處理組大鼠在目標(biāo)象限游泳時(shí)間所占百分比為(27.75±4.04)%，HI組為(19.75±2.80)%，假手術(shù)組為(29.00±4.37)%。3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.93，P<0.001)，預(yù)處理組與HI組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

評(píng)價(jià)有關(guān)空間學(xué)習(xí)和記憶認(rèn)知測(cè)試的方法有很多[7-9]，但Morris水迷宮是公認(rèn)的評(píng)價(jià)與認(rèn)知功能有關(guān)的空間學(xué)習(xí)和記憶能力的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試系統(tǒng)[10-13]，Morris水迷宮是一種應(yīng)激性測(cè)試，能較準(zhǔn)確的反映學(xué)習(xí)和記憶能力，這一特點(diǎn)已經(jīng)在一個(gè)研究中得到證實(shí)[14]。該實(shí)驗(yàn)包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)；定位航行實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)空間學(xué)習(xí)能力，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括游泳時(shí)間和游泳距離，學(xué)習(xí)能力下降時(shí)，游泳時(shí)間延長(zhǎng)，游泳距離增加；空間探索實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)記憶能力，評(píng)價(jià)指標(biāo)是目標(biāo)象限游泳時(shí)間的百分比。而且，有關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)海馬和大腦皮質(zhì)與學(xué)習(xí)和記憶能力有關(guān)，神經(jīng)元損傷可導(dǎo)致認(rèn)知功能下降[10，12，15-20]。有研究表明：海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元比CA3區(qū)神經(jīng)元明顯敏感，因?yàn)楹ｑRCA1區(qū)含有比CA3區(qū)神經(jīng)元較高的超氧陰離子[21]。而且，從CA1區(qū)神經(jīng)元分離的線粒體比CA3區(qū)釋放更多的ROS[22]，所以海馬CA1區(qū)對(duì)HI較敏感。生后28～33 d的大鼠按照腦發(fā)育的過(guò)程來(lái)講其相當(dāng)于2歲左右的幼兒[22]，這一階段是學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵時(shí)期。因此，本研究選擇生后28～33 d的大鼠作為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)和記憶能力。

曾經(jīng)有研究報(bào)道，肌肽對(duì)轉(zhuǎn)基因缺血大鼠的認(rèn)知功能無(wú)明顯影響[23]。本研究結(jié)果表明，肌肽預(yù)處理降低了HI大鼠的游泳時(shí)間和游泳距離，增加了大鼠在目標(biāo)象限游泳時(shí)間的百分比，因此改善了由于HI導(dǎo)致的遠(yuǎn)期空間學(xué)習(xí)和記憶能力下降，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道不一致，分析其原因可能是由于模型不同，鼠齡不同有關(guān)。本課題組曾經(jīng)通過(guò)TUNEL染色證實(shí)肌肽預(yù)處理后HI大鼠大腦皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少。肌肽預(yù)處理后海馬和大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少與改善HI大鼠認(rèn)知功能有關(guān)[24]。

總之，肌肽預(yù)處理不僅改善由于HI誘導(dǎo)的腦損傷的生理和病理變化，而且也改善了HI大鼠的遠(yuǎn)期認(rèn)知功能。這些結(jié)果表明：肌肽有可能成為一個(gè)有前途的腦損傷神經(jīng)保護(hù)藥物，并有可能為臨床腦損傷的治療開辟新的途徑。

[1] Rajanikant GK，Zemke D，Senut MC，et al.Carnosine is neuroprotective against permanent focal cerebral ischemia in mice[J].Stroke，2007，38(11)：3023-3031.

[2] Min J，Senut MC，Rajanikant K，et al.Differential neuroprotective effects of carnosine，anserine，and N-acetyl carnosine against permanent focal ischemia[J].J Neurosci Res，2008，86(13)：2984-2991.

[3] Dobrota D，F(xiàn)edorova T，Stvolinsky S，et al.Carnosine protects the brain of rats and Mongolian gerbils against ischemic injury：after-stroke-effect[J].Neurochem Res，2005，30 (10)：1283-1288.

[4] Aydín AF，Küskü-Kiraz Z，Doqru-Abbasoqlu S，et al.Effect of carnosine treatment on oxidative stress in serum，apoB-containing lipoproteins fraction and erythrocytes of aged rats[J].Pharmacol Rep，2010，62(4)：733-739.

[5] Aydin AF，Kücükgergin C，Ozdemirler-Erata G，et al.The effect of carnosine treatment on prooxidant-antioxidant balance in liver，heart and brain tissues of male aged rats[J].Biogerontology，2010，11(1)：103-109.

[6] Barhwal K，Singh SB，Hota SK，et al.Acetyl-L-carnitine ameliorates hypobaric hypoxic impairment and spatial memory deficits in rats[J].Eur J Pharmacol，2007，570(1-3)：97-107.

[7] Holmes A，Wrenn CC，Harris AP，et al.Behavioral profiles of inbred strains on novel olfactory，spatial and emotional tests for reference memory in mice[J].Genes Brain Behav，2002，1(1)：55-69.

[8] Holscher C，Schmid S，Pilz PK，et al.Lack of the metabotropic glutamate receptor subtype 7 selectively impairs short-term working memory but not long-term memory[J].Behav Brain Res，2004，154(2)：473-481.

[9] Lange-Asschenfeldt C，Lohmann P，Riepe MW.Spatial performance in a complex maze is associated with persistent long-term potentiation enhancement in mouse hippocampal slices at early training stages[J].Neuroscience，2007，147(2)：318-324.

[10] Gozal E，Row BW，Schurr A，et al.Developmental differences in cortical and hippocampal vulnerability to intermittent hypoxia in the rat[J].Neurosci Lett，2001，305(3)：197-201.

[11] Ikeda T，Mishima K，Yoshikawa T，et al.Selective and long-term learning impairment following neonatal hypoxic-ischemic brain insult in rats[J].Behav Brain Res，2001，118(1)：17-25.

[12] Row BW，Kheirandish L，Neville JJ，et al.Impaired spatial learning and hyperactivity in developing rats exposed to intermittent hypoxia[J].Pediatr Res，2002，52(3)：449-453.

[13] Vorhees CV，Williams MT.Morris water maze：procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory[J].Nat Protoc，2006，1(2)：848-858.

[14] Zhao P，Peng L，Li L，et al.Isoflurane preconditioning improves long-term neurologic outcome after hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rats[J].Anesthesiology，2007，107(6)：963-970.

[15] D'Hooge R，De Deyn PP.Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory[J].Brain Res Brain Res Rev，2001，36(1)：60-90.

[16] Farr SA，F(xiàn)lood JF，Morley JE.The effect of cholinergic，GABAergic，serotonergic，and glutamatergic receptor modulation on posttrial memory processing in the hippocampus[J].Neurobiol Learn Mem，2000，73(2)：150-167.

[17] Hagewoud R，Havekes R，Novati A，et al.Sleep deprivation impairs spatial working memory and reduces hippocampal AMPA receptor phosphorylation[J].J Sleep Res，2010，19(2)：280-288.

[18] Hok V，Save E，Lenck-Santini PP，et al.Coding for spatial goals in the prelimbic/infralimbic area of the rat frontal cortex[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102(12)：4602-4607.

[19] Sargolini F，Roullet P，Oliverio A，et al.Effects of intra-accumbens focal administrations of glutamate antagonists on object recognition memory in mice[J].Behav Brain Res，2003，138 (2)：153-163.

[20] Steffenach HA，Witter M，Moser MB，et al.Spatial memory in the rat requires the dorsolateral band of the entorhinal cortex[J].Neuron，2005，45(2)：301-313.

[21] Wang X，Pal R，Chen XW，et al.High intrinsic oxidative stress may underlie selective vulnerability of the hippocampal CA1 region[J].Brain Res Mol Brain Res，2005，140(1-2)：120-126.

[22] Mattiasson G，F(xiàn)riberg H，Hansson M，et al.Flow cytometric analysis of mitochondria from CA1 and CA3 regions of rat hippocampus reveals differences in permeability transition pore activation[J].J Neurochem，2003，87(2)：532-544.

[23] Pekcetin C，Kiray M，Ergur BU，et al.Carnosine attenuates oxidative stress and apoptosis in transient cerebral ischemia in rats[J].Acta Biol Hung，2009，60(2)：137-148.

[24] 張香敏，張展，程秀永，等.肌肽對(duì)缺氧缺血性腦損傷大鼠凋亡生化指標(biāo)的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué)，2014，6(1)：41-44.