田迎，滕兆剛，盧光明，鄭玲

0 引言

近年來(lái)，納米材料在醫(yī)藥領(lǐng)域的研究越來(lái)越廣泛，如修飾后具有熒光或磁性性能的納米顆粒能夠用于細(xì)胞標(biāo)記、示蹤、造影;裝載藥物的介孔納米材料可以實(shí)現(xiàn)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)及靶向治療［1－4］。與此同時(shí)，納米材料的生物安全性也受到關(guān)注，其大小與表面物化性質(zhì)都是決定細(xì)胞毒性的重要因素［5－8］。納米材料的分散性對(duì)于細(xì)胞凋亡的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)制備2種分散性不同的介孔二氧化硅納米材料(mesoporous silica nanomaterials，MSNs)，初步探索其對(duì)人胚腎細(xì)胞系293T細(xì)胞吞噬以及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料MSN-1、MSN-2為本實(shí)驗(yàn)室滕兆剛博士制備合成，人胚腎細(xì)胞系293T細(xì)胞購(gòu)自ATCC(American type culture collection)細(xì)胞庫(kù)，DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗溶液、胎牛血清及胰酶購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 主要方法

1.2.1 MSN-1、MSN-2的制備和表征MSN-1、MSN-2

分別參照文獻(xiàn)［9－10］的方法制備。MSN-1、MSN-2利用透射電鏡方法進(jìn)行表征，加速電壓為200 kV。首先配制0.05 g/L納米粒的乙醇溶液，超聲分散均勻后，滴于覆蓋有膜的銅網(wǎng)上，真空干燥后，于Hitachi H-8100型透射電子顯微鏡下拍攝，觀察納米粒的尺寸及分散性。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)293T細(xì)胞于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每48h傳代1次。

1.2.3 透射電鏡觀察293T細(xì)胞對(duì)MSN-1、MSN-2的攝取待293T細(xì)胞匯合度達(dá)70%時(shí)，分別加入混合均勻的MSN-1、MSN-2，使其終濃度為100 μg/mL，孵育24 h，清洗消化，收集細(xì)胞，用2.5%戊二醛固定、1%鋨酸后固定1 h，丙酮脫水，Epon-812樹(shù)脂包埋，45～65℃聚合48h，半薄切片定位，70nm超薄切片，醋酸鈾—檸檬酸鉛雙重電子染色，JEM-1011型透射電鏡觀察細(xì)胞對(duì)材料的吞噬結(jié)果。

1.2.4 流式細(xì)胞儀分析MSN-1、MSN-2對(duì)293T細(xì)胞凋亡的影響將細(xì)胞接種于6孔板上，每孔細(xì)胞數(shù)量約5×105，待細(xì)胞貼壁且達(dá)到70%匯合度時(shí)，分別加入濃度為0(對(duì)照)、100、150、200和250 μg/mL的MSN-1、MSN-2，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)孔。培養(yǎng)箱孵育24 h，PBS洗滌收集細(xì)胞，分別加入500 μL的Binding buffer、5 μL的Annexin V-FITC、5 μL Propidium Iodide，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm。具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。定量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。2組間的均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間方差不齊(以0.1作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行Levene檢驗(yàn))時(shí)采用Satterthwaite校正t檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡觀察MSN-1和MSN-2的尺寸及分散性MSN-1、MSN-2制備后裝入容器，待沉淀后觀察，MSN-2均勻分散在溶液中，MSN-1見(jiàn)分層，見(jiàn)圖1a。進(jìn)一步分析透射電鏡結(jié)果，2種納米粒呈球狀，尺寸均在100 nm左右;MSN-1顆粒之間有連接，見(jiàn)圖1b，MSN-2分散性較好，與圖1a結(jié)果一致，見(jiàn)圖1c。

2.2 人胚腎細(xì)胞系293T細(xì)胞吞噬納米粒MSN-1和MSN-2293T細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)良好，見(jiàn)圖2a;通過(guò)透射電鏡觀察293T細(xì)胞對(duì)MSN-1和MSN-2這2種材料均有攝取，計(jì)數(shù)結(jié)果顯示大約10%的納米粒被細(xì)胞吞噬;因MSN-1顆粒之間有連接，進(jìn)入細(xì)胞后成團(tuán)聚狀，見(jiàn)圖2c;MSN-2顆粒在細(xì)胞中分散性也相對(duì)明顯，見(jiàn)圖2d。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果不同濃度梯度的MSN-1，MSN-2(0、100、150、200和250 μg/mL)與293T細(xì)胞共同孵育24 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示與對(duì)照(0 μg/mL)濃度比較，100、150、200和250 μg/mL的MSN-1對(duì)293T細(xì)胞的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);MSN-2組并未引起明顯的細(xì)胞凋亡反應(yīng)，見(jiàn)圖3，表1。

表1 MSNs對(duì)293T細(xì)胞凋亡的影響(x±s，%)Table 1 The cell apoptosis of 293T impacted by the two MSNs(x±s，%)

圖1 靜置狀態(tài)與透射電鏡下觀察MSNs的分散性Figure 1 The dispersion of two MSNs by transmission electron microscopy and after precipitation

圖2 透射電鏡觀察人胚腎細(xì)胞系293T對(duì)2種MSNs的攝取Figure 2 The human embryonic kidney cell 293T and the phagocytosis to the two MSNs by transmission electron microscopy

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的MSNs影響細(xì)胞凋亡的結(jié)果Figure 3 The cell apoptosis results induced by MSNs with different concentration by flow cytometer

3 討論

由于介孔納米材料具有規(guī)則的孔徑結(jié)構(gòu)和較大的表面積，有利于反應(yīng)物的擴(kuò)散，并能在孔道內(nèi)裝載藥物，從而實(shí)現(xiàn)疾病的靶向治療，在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域顯示出重要的應(yīng)用前景［11－13］。隨著介孔材料研究的深入和應(yīng)用的推廣，其生物安全性成為目前關(guān)注的熱點(diǎn)。介孔材料的大小、結(jié)構(gòu)、分散性及表面性質(zhì)等理化因素均有可能影響細(xì)胞骨架和細(xì)胞核的完整性與穩(wěn)定性，影響細(xì)胞某些生物學(xué)功能，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡反應(yīng)［14－16］。

本文主要研究2種分散性不同的MSNs對(duì)人正常細(xì)胞系如人胚腎細(xì)胞系293T細(xì)胞的影響，考察其對(duì)細(xì)胞的吞噬和凋亡，為接下來(lái)的載藥治療提供研究基礎(chǔ)。透射電鏡的結(jié)果表明，2種MSNs的分散性不同，仍有大約10%的材料進(jìn)入細(xì)胞，被溶酶體包被;同時(shí)分散性也影響材料在細(xì)胞中的狀態(tài)，分散性好的材料進(jìn)入細(xì)胞后仍有良好的分散性，顆粒狀明顯，分散性差的材料進(jìn)入細(xì)胞后成團(tuán)聚狀態(tài)。凋亡是一種程序性的、正常的細(xì)胞死亡，本實(shí)驗(yàn)利用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同濃度梯度下2種MSNs對(duì)293T細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示分散性不佳的材料MSN-1隨著孵育濃度的增加，引起293T細(xì)胞的凋亡，分析原因可能由于材料進(jìn)入細(xì)胞后成團(tuán)聚狀態(tài)，導(dǎo)致自噬泡局部濃度過(guò)高，與溶酶體結(jié)合后，降解胞內(nèi)大分子或細(xì)胞器，過(guò)度的自噬引起細(xì)胞凋亡［17］。而MSN-2分散性較好，并未引起明顯的凋亡反應(yīng)，提示此材料在胞內(nèi)濃度達(dá)到250 μg/mL時(shí)不會(huì)引起細(xì)胞明顯的毒性反應(yīng)。

總之，闡明納米材料的生物安全性，并合理設(shè)計(jì)和優(yōu)化材料的功能結(jié)構(gòu)才能拓展其在生物、醫(yī)藥方面的研究，實(shí)現(xiàn)向臨床應(yīng)用等跨學(xué)科領(lǐng)域的轉(zhuǎn)換，顯示其重要的價(jià)值。

［1］Tang N，Du G，Wang N，et al.Improving penetration in tumors with nanoassemblies of phospholipids and doxorubicin［J］.J Natl Cancer Inst，2007，99(13):1004-1015.

［2］Deshpande N，Needles A，Willmann JK.Molecular ultrasound imaging:current status and future directions［J］.Clin Radiol，2010，65(7):567-581.

［3］Ke H，Wang J，Dai Z，et al.Gold-nanoshelled microcapsules:a theranostic agent for ultrasound contrast imaging and photothermal therapy［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2011，50(13):3017-3021.

［4］朱役，賈紹昌，蔡凱，等.靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的納米顆粒制備及其對(duì)大腸癌細(xì)胞株SW620的作用［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2011，24(10):1019-1022.

［5］Song Y，Li X，Du X.Exposure to nanoparticles is related to pleural effusion，pulmonary fibrosis and granuloma［J］.Eur Respir J，2009，34(3):559-567.

［6］Lewinski N，Colvin V，Drezek R.Cytotoxicity of nanoparticles［J］.Small，2008，4(1):26-49.

［7］Yang Z，Zhang Y，Yang Y，et al.Pharmacological and toxicological target organelles and safe use of single-walled Carbon nanotubes as drug carriers in treating Alzheimer disease［J］.Nanomedicine，2010，6(3):427-441.

［8］Medina C，Santos-Martinez MJ，Radomski A，et al.Nanoparticles:pharmacological and toxicological significance［J］.Br J Pharmacol，2007，150(5):552-558.

［9］Lu F，Wu SH，Hung Y，et al.Size effect on cell uptake in wellsuspended，uniform mesoporous silica nanoparticles［J］.Small，2009，5(12):1408-1413.

［10］Teng ZG，Han YD，Li J，et al.Preparation of hollow mesoporous silica spheres by a sol-gel/emulsion approach［J］.Microporous Mesoporous Mater，2010，127(1-2):67-72.

［11］Liu Y，Wang H.Nanomedicine:Nanotechnology tackles tumours［J］.Nat Nanotechnol，2007，2(1):20-21.

［12］孫加司，陳思嬌，史記，等.納米金檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的應(yīng)用進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2012，25(1):85-88.

［13］Amirfazli A.Nanomedicine:magnetic nanoparticles hit the target［J］.Nat Nanotechnol，2007，2(8):467-468.

［14］Elder A，Yang H，Gwiazda R，et al.Testing nanomaterials of unknown toxicity:an example based on platinum nanoparticles of different shapes［J］.Adv Mater，2007，19(20):3124-3129.

［15］Unfried K，Albrecht C，Klotz LO，et al.Cellular responses to nanoparticles:target structures and mechanisms［J］.Nanotoxicology，2007，1(1):52-71.

［16］Faraji AH，Wipf P.Nanoparticles in cellular drug delivery［J］.Bioorg Med Chem，2009，17(8):2950-2962.

［17］Okada H，Mark TW.Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells［J］.Nat Rev Cancer，2004，4(8):592-603.