周繼文，王恒，周揚，陳文昭，汪桃芳，劉志禮，付達(dá)華

0 引言

骨肉瘤是多發(fā)于青少年的一種增殖及侵襲性極強的惡性腫瘤，早期轉(zhuǎn)移是其一大特點，肺部轉(zhuǎn)移成為骨肉瘤患者死亡最主要的原因。已有研究證實印尼蛇接骨草醇提取物能誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，抑制其增殖［1］。在本實驗中，我們進(jìn)一步探討了蛇接骨草醇提取物對骨肉瘤細(xì)胞U2-OS遷徙、侵襲力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料蛇接骨草購于江西南豐印尼蛇接骨草種植基地，提取方法見文獻(xiàn)［1］。骨肉瘤細(xì)胞株U2-OS購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所，并由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心凍存。F12型培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程有限公司;PBS購自北京百靈威化學(xué)試劑有限公司;胰蛋白酶凍干粉(含EDTA)購自美國Sigma公司;DMSO、MTT購自美國Sigma公司，Transwell趨化板購于Costar公司(8.0μm Pore Size)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞株U2-OS細(xì)胞貼壁生長于含10%FBS的F12型培養(yǎng)液中，其中青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/mL，于37℃、5%CO2的飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至約80%滿后，棄去舊培養(yǎng)基，以適量胰酶(0.25%胰蛋白酶:0.02%EDTA=1∶1)消化細(xì)胞，棄去消化液并加入適量培養(yǎng)基洗滌，再以適量培養(yǎng)基反復(fù)輕輕吹打后制備細(xì)胞懸液，計數(shù)，以1∶4的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 Wound healing遷徙實驗取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗;用0.25%胰酶消化細(xì)胞，含10 g/L BSA的無血清DMEM-F12培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度5×105/mL，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，予以2種不同濃度(0、40 μg/mL)的GPE作用細(xì)胞24 h后，用200 μL槍頭在單層細(xì)胞表面孔中劃一直線。用PBS漂洗2次以去除劃下的懸浮細(xì)胞;加入無血清DMEM-F12培養(yǎng)液(內(nèi)含1%BSA)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察劃痕中細(xì)胞遷徙情況并照相;Image J分析軟件進(jìn)行遷徙距離測量，計算各組細(xì)胞遷徙率。不同時間重復(fù)實驗6次。

1.2.3 Transwell侵襲實驗將凍存于－80℃冰箱的BD matrigel基質(zhì)膠40C靜置24 h，使之轉(zhuǎn)為液態(tài)。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)后，終止培養(yǎng)，吸除血清讓細(xì)胞饑餓12～24 h。包被基膜，按1∶7比例稀釋Matrigel，取20μL的Matrigel，加入140μL的F12型無血清培養(yǎng)液，充分稀釋混勻(冰浴操作)。在Transwell小室的多聚碳酸濾膜上預(yù)鋪Matrigel基質(zhì)膠(約60 μL/孔)，每孔加入50 μL的含10 g/L的BSA(牛血清白蛋白)的無血清培養(yǎng)液，37℃放置3h，室溫過夜干燥。常規(guī)消化離心細(xì)胞后，用10g/L BSA(牛血清白蛋白)重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個/mL。在Transwell小室的上室中，分別加入150 μL的已用40 μg/mL GPE處理的細(xì)胞懸液和用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞懸液，每孔下室加入500 μL的含血清的培養(yǎng)基。將小室置于37℃、5%CO2孵育箱中24 h后用棉簽輕輕刮除小室內(nèi)微孔膜邊緣的細(xì)胞，甲醇固定15 min，再用4 g/L的結(jié)晶紫染色30 min后取出Transwell小室，PBS淋洗2遍，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞穿膜情況并拍照，Image J分析軟件計數(shù)。不同時間重復(fù)實驗6次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用兩獨立樣本t檢驗比較2組間細(xì)胞遷徙與侵襲差異情況，2組間方差不齊時采用Satterthwaite校正t檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 印尼蛇接骨草95%醇提取物［Gynura procumbens(Lour.)MERR.extract，GPE］對骨肉瘤細(xì)胞U2-OS體外遷徙的影響wound healing實驗結(jié)果顯示，在200倍的鏡下觀察經(jīng)40μg/mL GPE作用24h的平均細(xì)胞遷徙率為(33±3)%，未經(jīng)GPE作用的細(xì)胞組遷徙率為(66±2)%。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 不同濃度的GPE作用骨肉瘤細(xì)胞U2-OS后的劃痕愈合鏡下所見(×200)Figure 1 Wound healing pictures of the U2-OS cells after treated with GPE(×200)

2.2 GPE對骨肉瘤細(xì)胞U2-OS體外侵襲的影響通過Transwell侵襲實驗分析顯示，40 μg/mL GPE處理的細(xì)胞24 h穿膜細(xì)胞數(shù)平均為(18±2)個/視野，未經(jīng)GPE作用的細(xì)胞平均穿膜細(xì)胞數(shù)為(46±2)個/視野，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 Transwell侵襲實驗代表圖(結(jié)晶紫染色法×400)Figure 2 Representative images of Transwell invasion assay of the U2-OS cells after treated with GPE(Crystal violet staining×400)

3 討論

骨肉瘤是一種高度惡性的骨腫瘤，其發(fā)病率在兒童及青少年的原發(fā)骨腫瘤中占據(jù)首位。雖然新輔助化療藥已使用，但近30年來骨肉瘤患者總體生存率沒有得到了提高，主要原因是早期發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移和獲得性耐藥［2－3］。因此，新的抗骨肉瘤藥物的出現(xiàn)是亟待解決的熱點。印尼蛇接骨草廣泛分布于包括中國、印度尼西亞等東南亞國家，在民間被認(rèn)為具有抗癌作用而廣泛作為中藥和食物食用。目前藥理學(xué)證明其具有抗炎、抗病毒、抗高血壓、降血脂、降血糖等作用［4－8］，但其是否具有抗腫瘤效果目前少見報道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，GPE能誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖［1］，但是否具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用未見報道。最近研究發(fā)現(xiàn)蛇接骨草乙醇提取物能在人成纖維細(xì)胞中抑制紫外線誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)［9］。目前研究已證實基質(zhì)金屬蛋白酶是細(xì)胞基底膜及外基質(zhì)降解過程中不可缺少的一類酶，并且大量的研究表明在腫瘤組織中基質(zhì)金屬蛋白酶異常高表達(dá)，可作為預(yù)測腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的指標(biāo)［11－13］，而基膜及細(xì)胞外基質(zhì)的降解破壞在骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移中至關(guān)重要，被認(rèn)為是骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們的研究結(jié)果表明，經(jīng)40 μg/mL GPE作用后的細(xì)胞細(xì)胞遷徙率和侵襲力明顯低于未經(jīng)GPE作用的細(xì)胞，這提示GPE能有效抑制骨肉瘤細(xì)胞遷徙侵襲。

藥用植物在腫瘤的治療中發(fā)揮作用的機制復(fù)雜。本研究中，GPE是由多種成分組成的混合物，其抗腫瘤作用是由1種還是由多種成分協(xié)同作用產(chǎn)生，活性成分及其作用靶點分別是什么，都有待于進(jìn)一步研究。

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