劉陽(yáng)，高德玉，張萍，徐敏，李曉軍

0 引言

分化抑制因子又稱DNA結(jié)合抑制因子(inhibitors of differentiation/DNA binding，Id)，屬于螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix，HLH)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，其本身缺乏DNA結(jié)合必需的堿性結(jié)構(gòu)域，與堿性HLH(basic helix-loop-helix，bHLH)結(jié)合成異二聚體后，可抑制bHLH與DNA及其他組織特異性bHLH結(jié)合，從而負(fù)調(diào)節(jié)bHLH轉(zhuǎn)錄因子，抑制細(xì)胞分化。目前共發(fā)現(xiàn)4種Id分子，即Id1、Id2、Id3和Id4，在真核生物中，Id蛋白在胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤血管形成、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用［1］。

Id3基因參與多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程［2］，包括淋巴細(xì)胞成熟和發(fā)育、血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞增殖和分化、胚胎心血管及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和形成等［3］。Id3在細(xì)胞中的表達(dá)模式和調(diào)控機(jī)制與Id1不完全相同，Id3在不同類別的腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中具有截然不同的表達(dá)模式，在原發(fā)性結(jié)直腸癌、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)［4］，而在甲狀腺癌、卵巢癌、前列腺癌中表達(dá)水平低下［5］;在肝病或肝癌中，其表達(dá)模式更加復(fù)雜，在分化良好的肝癌細(xì)胞中Id3的表達(dá)水平高于分化不良的肝癌細(xì)胞［6］。

為進(jìn)一步探討Id3基因在肺腺癌細(xì)胞中的作用，本實(shí)驗(yàn)在前期構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP/Id3的基礎(chǔ)上，觀察Id3轉(zhuǎn)基因表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲、增殖和凋亡的影響，為進(jìn)一步研究Id3對(duì)A549細(xì)胞功能的影響及其分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料人肺腺癌A549細(xì)胞由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)科保存，PCR儀由eppendorf公司生產(chǎn)，熒光倒置顯微鏡購(gòu)于Olympus公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自Fermentas公司，TRIzol試劑購(gòu)自Takara公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司，LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司，OPTI MEM購(gòu)自GIBCO公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自Dojindo公司，DAPI染色液和hoechst 33258染色試劑盒購(gòu)自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中(37℃、5%CO2)。將細(xì)胞按照2×105個(gè)/孔接種于12孔板，待各孔細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合，按照說(shuō)明書(shū)用LipofectamineTM2000試劑盒將細(xì)胞分為3組進(jìn)行處理:①pEGFP/Id3轉(zhuǎn)染組;②pEGFP轉(zhuǎn)染組;③空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染20 h后，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞Id3基因的表達(dá)轉(zhuǎn)染20 h后，用TRIZOL試劑提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增Id3基因，Id3引物:上游:5′-ATGAAGGCGCTGAGCCCGGTGC-3′;下游:5′-ACGGCCGAGTCAGTGGCAAAAGC-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為360 bp。GAPDH引物:上游:5′-CAACTAAGCGGCACAGAATG-3′;下游:5′-GCCAGTGGACTCCACGAC-3′，產(chǎn)物大小為180 bp。PCR擴(kuò)增后將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.3 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)將A549細(xì)胞按2×105個(gè)/孔的密度接種于12孔板，待每組細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合，用1.2.1所述方法將細(xì)胞分為3組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，20 h后，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，用200 μL移液器槍頭在培養(yǎng)板的孔中央劃一條直線，無(wú)菌PBS清洗2遍，洗去漂浮的細(xì)胞，每孔加1000μL無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，倒置顯微鏡下觀察、拍照。每個(gè)孔觀察5個(gè)視野，每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 體外侵襲能力測(cè)定將A549細(xì)胞按上述方法轉(zhuǎn)染12 h后，收集各組細(xì)胞，在12孔板的每孔加1500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將NUNC插入式細(xì)胞培養(yǎng)器小室放入12孔板中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/孔，每個(gè)小室加700 μL無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽將小室上表面的細(xì)胞輕輕擦掉，用4%多聚甲醛固定20 min，然后用蘇木精染色20 min，在倒置顯微鏡下觀察上、下、左、右、中5個(gè)視野，計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。

1.2.5 明膠酶譜法將A549細(xì)胞接種6孔板，按上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染20 h后，將培養(yǎng)基換為無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30 h，收集上清液，進(jìn)行蛋白定量后，將各組蛋白濃度調(diào)整至一致，與上樣緩沖液混合，于4℃在含0.1%明膠的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后，將凝膠置于含2.5%Triton X-100的洗脫液中振蕩洗脫2次，每次40 min，然后用漂洗液漂洗2次，每次20min，將凝膠置于孵育液中37℃孵育40 h?？捡R斯亮藍(lán)染液染色3 h，脫色至出現(xiàn)負(fù)染條帶。凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照并使用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 平板克隆形成試驗(yàn)按上述方法將A549細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染，20 h后，將細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，并將每組細(xì)胞按200個(gè)/皿的濃度接種于培養(yǎng)皿中，輕輕搖動(dòng)，使細(xì)胞分布均勻，置37℃、5%CO2環(huán)境靜置培養(yǎng)2～3周直至出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆。棄上清，加4%多聚甲醛固定20min，去固定液，加適量蘇木精染液染10 min。用流水緩慢洗去染液，空氣干燥并計(jì)數(shù)克隆。用下列公式計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間均數(shù)比較用單因素方差分析，多組數(shù)據(jù)之間的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Id3-EGFP在A549細(xì)胞中的表達(dá)分析將細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染20 h后，于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pEGFP/Id3和pEGFP后細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，而未轉(zhuǎn)染EGFP的細(xì)胞無(wú)綠色熒光，pEGFP/Id3轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光主要表達(dá)于細(xì)胞核，pEGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光則均勻表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，見(jiàn)圖1。RT-PCR結(jié)果顯示，pEGFP/Id3組細(xì)胞Id3 mRNA的表達(dá)量明顯高于pEGFP組細(xì)胞和空白對(duì)照組細(xì)胞，見(jiàn)圖2。Quantity One分析軟件進(jìn)行灰度分析結(jié)果顯示，pEGFP/Id3轉(zhuǎn)染組的Id3/GAPDH為1.274±0.035，較pEGFP轉(zhuǎn)染組(0.584±0.011)和空白對(duì)照組(0.636±0.035)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而pEGFP轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后EGFP的表達(dá)情況(×400)Figure 1 Expression of EGFP after transfection by fluorescence microscopy(×400)

圖2 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞Id3 mRNA的表達(dá)量Figure 2 Expression of Id3 observed by RT-PCR

2.2 Id3基因表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞劃痕48 h后，pEGFP/Id3轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞遷移數(shù)［(113.75±25.04)個(gè)］明顯低于空白對(duì)照組［(254.75±41.06)個(gè)］和pEGFP轉(zhuǎn)染組［(228.25±26.84)個(gè)］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，pEGFP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和空白對(duì)照組細(xì)胞遷移率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 Id3基因表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞體外侵襲能力的影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染20 h后，pEGFP/Id3轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)［(57.00±9.88)個(gè)］明顯低于空白對(duì)照組［(88.00±14.81)個(gè)］和pEGFP轉(zhuǎn)染組［(83.71±19.11)個(gè)］(P＜0.01)。pEGFP組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示Id3轉(zhuǎn)基因表達(dá)能減弱A549細(xì)胞的體外侵襲性。

2.4 Id3基因表達(dá)對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)和MMP9活性的影響將細(xì)胞進(jìn)行分組處理后，收集上清液進(jìn)行明膠酶譜試驗(yàn)，條帶的強(qiáng)弱能夠半定量地反映明膠酶活性的大小。用Quantity One分析軟件進(jìn)行灰度分析結(jié)果顯示:pEGFP/Id3轉(zhuǎn)染組MMP2和MMP9灰度明顯低于pEGFP轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而pEGFP轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組的MMP2和MMP9的灰度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1、圖3。

表1 各處理組MMP2和MMP9灰度分析結(jié)果比較(x±s)Table 1 Comparison of gray level analysis results for MMP2 and MMP9 from each group(x±s)

圖3 Id3基因?qū)MP2和MMP9活性的影響Figure 3 Effects of Id3 on the activity of MMP2 and MMP9

2.5 平板克隆形成數(shù)判定細(xì)胞群體依賴性和增殖能力通過(guò)計(jì)數(shù)細(xì)胞集落形成的數(shù)目發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染外源性Id3基因可抑制A549細(xì)胞群體依賴性生長(zhǎng)作用。與空白對(duì)照組相比，pEGFP/Id3轉(zhuǎn)染組的克隆形成率明顯降低［(37.83±4.16)%vs(15.67±5.75)%，P＜0.05］，而pEGFP轉(zhuǎn)染組克隆形成率［(31.17±3.40)%］與對(duì)照組相比則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4。

圖4 外源性Id3基因可抑制A549細(xì)胞集落的形成Figure 4 Inhibitory effect of exogenous Id3 on the formation of cell colony

3 討論

肺腺癌是呈腺管樣或乳頭狀結(jié)構(gòu)的肺部惡性腫瘤，約占肺癌的20%～30%，可較早發(fā)生轉(zhuǎn)移，女性相對(duì)多見(jiàn)，目前該病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。分子靶向治療已經(jīng)成為目前肺癌治療研究的熱點(diǎn)［7-8］，Id分子除了具有促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞分化的功能外，還具有更特殊多樣的生物學(xué)作用。Id3表達(dá)調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性決定了其功能的多樣性，不同的刺激因素誘導(dǎo)不同來(lái)源和不同發(fā)育階段的細(xì)胞，可通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和機(jī)制調(diào)節(jié)Id3的表達(dá)。本研究通過(guò)將外源性Id3基因轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，以觀察Id3基因過(guò)表達(dá)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。

腫瘤轉(zhuǎn)移是由一系列復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程組成，這一過(guò)程是由細(xì)胞和基因2個(gè)水平所控制，而基因水平的控制更為關(guān)鍵，腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的過(guò)表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的表達(dá)不足，是引起腫瘤轉(zhuǎn)移的主要原因。通過(guò)體外侵襲遷移模型我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Id3基因后穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，同時(shí)向“傷口”遷移的能力也明顯減弱。MMPs是是依賴Zn2+的內(nèi)肽酶大家族的一員，MMPs幾乎可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有蛋白成分［9］，MMPs參與了很多生物活性因子如細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的形成，能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境并參與了早期的腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程［10］，明膠酶譜試驗(yàn)中SDS可與樣品中的MMPs結(jié)合，從而使其不能發(fā)揮分解明膠的作用，當(dāng)置Triton中洗脫后可使其恢復(fù)活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組細(xì)胞均可檢測(cè)到MMP2和MMP9，且轉(zhuǎn)染Id3基因后MMP2和MMP9活性顯著下降，表明Id3基因可以下調(diào)A549細(xì)胞MMP2和MMP9的表達(dá)，結(jié)合“劃痕”試驗(yàn)、Transwell試驗(yàn)和明膠酶譜試驗(yàn)的結(jié)果，我們可以得出Id3轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以減弱A549細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的結(jié)論。

Id3基因?qū)Σ煌?xì)胞的增殖有不同的作用，如Id3可促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖［11］，但也有研究表明，骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生骨成形蛋白-6和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，可通過(guò)上調(diào)Id3 mRNA的表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖，可阻止B淋巴細(xì)胞形成［12］。Lee等［13］發(fā)現(xiàn)Id3可抑制人胰腺β細(xì)胞P57Kip2表達(dá)，但是并不能促進(jìn)細(xì)胞增殖。通過(guò)平板克隆形成試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染外源性Id3基因后，細(xì)胞的克隆形成能力顯著下降，故認(rèn)為Id3的轉(zhuǎn)基因表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖呈抑制作用。

上述研究結(jié)果表明Id3基因可減弱A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力，同時(shí)還有抑制A549細(xì)胞增殖能力的作用。我們下一步將以此為基礎(chǔ)，通過(guò)基因芯片的方法，深入研究Id3轉(zhuǎn)基因表達(dá)前后的基因差異，從中找出影響細(xì)胞生物活性的關(guān)鍵因子，為肺癌的基因治療提供一個(gè)新的思路和靶點(diǎn)。

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