祝 強(qiáng)，王 婧，董 雋，史立新，張 旭，洪寶發(fā)

0 引 言

雌激素受體是雌激素作用于靶器官的重要路徑之一。雌激素水平、雌激素受體表達(dá)的差異，都會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)雌激素的不同應(yīng)答［1-3］。雌激素受體為配體依賴的類固醇超家族成員之一，有α，β 2種亞型，雖有高度同源性，但功能不同［4］。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有高度自我更新和多向分化的潛能，可以定向或橫向分化為多種細(xì)胞［5］，目前已成為生命科學(xué)中的研究熱點(diǎn)。作為雌激素靶器官的BMSCs，不僅表達(dá)ERα［6］，更與ERα的生理功能相關(guān)。隨著對(duì)ER研究的深入，有關(guān)ER的實(shí)驗(yàn)要求也隨之越來越高，如何建立一個(gè)穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)更好地進(jìn)行相關(guān)研究成了迫切需要解決的問題。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建大鼠ERα基因表達(dá)載體，并觀察其在rBMSCs中的表達(dá)，為進(jìn)一步探討ERα的生理功能，尤其是在研究雌激素靶器官中的信號(hào)通路奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡雌性SD大鼠，4只，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證號(hào):京動(dòng)字8910R018。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)范及倫理規(guī)范。SD大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境:空氣充足，12 h光照，室溫(22±2)℃，濕度45%～65%，自由飲食及飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 胎牛血清(美國Gibco公司)，DMEM培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)，總RNA提取試劑(北京欣博盛生物技術(shù)公司)，cDNA合成第一鏈試劑盒(日本Toyobo公司)，2×Trans Taq HIFI PCR SuperMixⅡ(北京全式金生物技術(shù)公司)，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ及XhoⅠ、T4 DNA連接酶、Prime STARTM HS DNA聚合酶、pMD18-T載體、DNA marker DL2000(大連寶生生物有限公司)，質(zhì)粒抽提及膠回收純化試劑盒(美國QIAGEN公司)，E.Coli菌株DH5(上海第二軍醫(yī)大學(xué)生化教研室)，pcDNA3.1(+)質(zhì)粒(美國 Invitrogen公司)，rBMSCs(廣州賽業(yè)公司)，LipofectamineLTX轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Invitrogen公司)，兔抗大鼠ERα、HRP標(biāo)記的羊抗-兔二抗(美國 SouthernBiotech公司)，SYBR green PCR master mix(北京基諾來普試劑公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 培養(yǎng)皿中置入預(yù)先切割好的薄蓋玻片(1cm×1 cm)，細(xì)胞以1×104/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，使細(xì)胞在蓋玻片上貼壁生長，培養(yǎng)2d。將爬滿細(xì)胞的蓋玻片取出，按照免疫組化染色方法，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脫水、固定、破膜、一抗孵育、二抗孵育、顯色、透明，晾干后，中性樹脂封片，顯微鏡觀察。

1.3.2 大鼠ERα基因的引物設(shè)計(jì)與cDNA合成①參照全長的ERα基因序列(GenBank序列號(hào)NM_012689)，設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增大鼠全長ERα的引物，上游引物F-ER:5'-GGATCCGCCGCCACCATGACCATGACCCTTCAC-3'，下游引物 R-ER:5'-CTCGAGAACTCAGATGGTGTTGGGGAAGCCCT-3'。上游引物引入BamHⅠ位點(diǎn)，下游引入XhoⅠ位點(diǎn)。引物由上海生工生物工程有限公司合成并經(jīng)PAGE純化定量。②大鼠子宮及雙側(cè)附件勻漿，Trizol抽提RNA。RNA電泳檢測結(jié)束后，對(duì)RNA濃度和A值進(jìn)行測定。反轉(zhuǎn)錄按照Toyobo反轉(zhuǎn)錄試劑盒First Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行。對(duì)于所用的試劑均用DEPC處理水配制，置于冰上，在超凈工作臺(tái)上操作。

1.3.3 ERα的 PCR擴(kuò)增 ①PCR反應(yīng)體系為:cDNA 5μL，M 正向(F)引物(10 μmol/L)1 μL，M 反向(R)引物(10μmol/L)1μL，2×Trans Taq HIFI PCR SuperMi×Ⅱ12.5 μL，去離子水 5.5 μL，終體積為25μL。②PCR反應(yīng)條件為:94℃ 3 min→40×(94℃30s→55℃ 30s→72℃ 1min→72℃ 5min→4℃∞，共35個(gè)循環(huán)。③擴(kuò)增結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μL在1%的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物檢測分析。

1.3.4 重組pcDNA3.1(+)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 按照DNA回收試劑盒的說明，回收純化PCR產(chǎn)物，與T載體連接，用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α。將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)菌涂布于含氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)平板。挑選生長菌落，堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA，以BamHⅠ+XhoⅠ酶切鑒定，并測序證實(shí)。

1.3.5 pcDNA3.1(+)/ERα 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 rBMSCs ①將復(fù)蘇成功并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期的rBMSCs以2×105個(gè)/孔的密度，接種于6孔板，加入無抗生素的DMEM，每孔2mL。②37℃孵箱孵育至細(xì)胞鋪滿孔板的60%～80%。轉(zhuǎn)染前1 d，確定細(xì)胞形態(tài)正常，培養(yǎng)液顏色、性狀正常。③按照LipofectamineLTX試劑盒說明書操作，轉(zhuǎn)染0.2μg重組質(zhì)粒于rBMSCs，同時(shí)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒作為對(duì)照，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 h。④去除培養(yǎng)液，加入含10%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后，提取細(xì)胞用做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 RT-PCR及Western blotting檢測鑒定轉(zhuǎn)染后產(chǎn)物①收集轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/ERα 后的rBMSCs，按照1.3.2與1.3.3 的方法提取總 RNA，RT-PCR 檢測 ERα mRNA的表達(dá)情況。②收集轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/ERα后的rBMSCs至1.5 mL離心管，離心半徑10 cm，離心轉(zhuǎn)速為5000r/min，離心5min后棄去培養(yǎng)液，加10倍體積的細(xì)胞裂解液于4℃裂解細(xì)胞沉淀30min，加適量的5×樣品緩沖液混合，100℃煮5min;離心1min，取上清電泳。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBS緩沖液洗膜、封閉，4℃過夜。加入兔抗大鼠ERα抗體(1∶1000)作為一抗，4℃過夜。HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體作為二抗，37℃孵育1h。TBST漂洗PVDF膜，ECL化學(xué)發(fā)光顯色。

1.3.7 MTT檢測 將細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的DMEM中，以104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，每孔200μL。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行MTT檢測。將25 mg/mL的MTT20 μL加入待測孔，37℃孵育4 h。去除上清液，加入150 μL的DMSO，震蕩10 min。選取490 nm的波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上，檢測每孔的光吸收值，記錄數(shù)值。

1.3.8 Realtime-PCR檢測 ①引物設(shè)計(jì)與合成 ERα:5'-GGATCCGCCGCCACCATGACCATGACCCTTCAC-3'，5'-CTCGAGAACTCAGATGGTGTTGGGGAAGCCCT-3';β-actin:5'-ACCTTCTACAATGAGCTGCG-3'，5'-CCTGGATAGCAACGTACATGG-3'。②提取RNA后，以反轉(zhuǎn)錄好的cDNA做為模板，進(jìn)行Realtime-PCR實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系為:SYBR Green熒光燃料MIX 5μL，引物 UP(10μmol/L)0.5μL，引物 Down(10μmol/L)0.5 μL，cDNA 第1 條反應(yīng)產(chǎn)物2μL，去離子水2 μL，總體積10 μL。③Realtime-PCR反應(yīng)程序:95℃ 5 min→95℃ 30s→40×(62℃30s)→4℃∞。④溶解曲線反應(yīng)程序:95℃ 15s→60℃ 15s→95℃ 15s。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩兩組間比較用 LSD檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化染色 以MCF-7細(xì)胞為陽性對(duì)照，rBMSCs的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中都可見ERα陽性棕色顆粒表達(dá)，以細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為多，見圖1。

圖1 ERα在rBMSCs中的表達(dá)Figure 1 Expression of ERα in rBMSCs

2.2 重組質(zhì)粒pcDNA-ERα的構(gòu)建及鑒定 抽提大鼠子宮及雙側(cè)附件總RNA，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，抽提的4只大鼠的總RNA均完整。將抽提的總RNA逆轉(zhuǎn)錄，以合成的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增全長ERα基因。將PCR產(chǎn)物純化回收，克隆入載體，以BamHⅠ+XhoⅠ酶切篩選出陽性重組子，并進(jìn)行DNA測序，測序結(jié)果顯示與GenBank公布序列(序列號(hào):NM_012689)完全吻合(結(jié)果未顯示)。重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)/ERα引入 BamHⅠ+XhoⅠ酶切位點(diǎn)，酶切鑒定，見圖2。

圖2 ERα質(zhì)粒的構(gòu)建Figure 2 Construction of pcDNA-ERα

2.3 重組質(zhì)粒在rBMSCs中表達(dá) 分別提取瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組［rBMSCs-pcDNA3.1(+)/ERα］、空載體轉(zhuǎn)染組［rBMSCs-pcDNA3.1(+)］、空白對(duì)照組(rBMSCs)細(xì)胞總RNA，做逆轉(zhuǎn)錄PCR。取RT-PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，在β-actin一致的條件下，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞ERα的表達(dá)與正常組、空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比有明顯升高，表明pcDNA3.1(+)/ERα轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，成功增加了ERα基因表達(dá)，見圖3a。

分別提取瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組［rBMSCs-pcDNA3.1(+)/ERα］、空載體轉(zhuǎn)染組［rBMSCs-pcDNA3.1(+)］、空白對(duì)照組(rBMSCs)細(xì)胞蛋白，做免疫印跡分析。Western blotting顯示，ERα蛋白在空轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞均有表達(dá)，而在轉(zhuǎn)染組條帶明顯增強(qiáng)，表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，成功增加了PELP1的蛋白表達(dá)，與基因水平鑒定結(jié)果相一致，見圖3b。

2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前后對(duì)細(xì)胞生長的影響 MTT顯示，ERα的高表達(dá)對(duì)細(xì)胞的生長產(chǎn)生了抑制，但3組細(xì)胞之間的生長曲線趨勢(shì)未發(fā)生明顯變化，見圖4a。Realtime-PCR顯示，在3組不同處理的細(xì)胞組中，ERαmRNA的表達(dá)存在差異，證明載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞后有效，在mRNA的水平成功增加了ERα的表達(dá)，見圖4b。

圖3 ERα轉(zhuǎn)染效率的檢測Figure 3 Influence of pcDNA-ERα transfection on ERα expression

圖4 Realtime-PCR與MTT檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞表達(dá)狀況Figure 4 Influence of pcDNA3.1(+)/ERα transfection on the growth of rBMSCs

3 討 論

高表達(dá)載體的建立，目前應(yīng)用的有多種方法［7-8］。為了最大程度地保證產(chǎn)物與模板的一致性，實(shí)驗(yàn)利用真核表達(dá)載體上的多克隆位點(diǎn)和重組質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)，將ERαcDNA定向連接于兩酶切位點(diǎn)間，成功構(gòu)建了ERα真核表達(dá)載體，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染使ERα可以在BMSCs中高表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中選擇陽性菌落進(jìn)行質(zhì)粒小量提取［9］，有利于簡化步驟，提高效率。構(gòu)建的真核表達(dá)載體經(jīng)酶切并測序后，證實(shí)結(jié)果與預(yù)期一致，表明ERα的真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，可作為轉(zhuǎn)移ERα的工具。本實(shí)驗(yàn)在選擇轉(zhuǎn)染方法上采用了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。因?yàn)榉€(wěn)定轉(zhuǎn)染需要進(jìn)行較長的穩(wěn)定篩選，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞不斷分化可能降低了其作為干細(xì)胞的特性。轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的狀態(tài)與轉(zhuǎn)染效率密切相關(guān)。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為貼壁生長的細(xì)胞，對(duì)數(shù)生長期為32h左右，轉(zhuǎn)染前24 h胰酶消化重新接種，轉(zhuǎn)染前4 h更換新鮮培養(yǎng)液，可以最大限度保證細(xì)胞的良好生長狀態(tài)?；蜣D(zhuǎn)入細(xì)胞后，對(duì)其表達(dá)的檢測受到時(shí)間限制，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷大，增殖較慢，過長的篩選時(shí)間會(huì)使細(xì)胞被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞淹沒，導(dǎo)致陽性克隆篩選失敗。本實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測，在基因和蛋白水平均成功檢測出了ERα的高表達(dá)。

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，可在條件分化液的作用下向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等分化［10-11］。作為雌激素的靶細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)也證明，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均表達(dá)ERα。有研究表明，ERα與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的骨向分化能力正相關(guān)［7］，參與細(xì)胞的多種生理功能。選擇骨髓基質(zhì)干細(xì)胞作為受體細(xì)胞，不僅可更深入地研究ERα功能，更能拓展骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的研究范圍，進(jìn)而開拓更廣的臨床應(yīng)用前景。

實(shí)時(shí)定量PCR動(dòng)力學(xué)較寬、在低表達(dá)水平下也可以分析基因表達(dá)的細(xì)微變化等，目前作為監(jiān)測基因表達(dá)的有效工具［12-13］。實(shí)時(shí)定量檢測結(jié)果顯示了基因由外源性插入后，在細(xì)胞中表達(dá)的時(shí)間性變化。在48 h時(shí)，基因的表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，基因表達(dá)水平隨之下降。本實(shí)驗(yàn)選取48 h作為細(xì)胞檢測時(shí)間點(diǎn)，可提高檢測效率。MTT檢測顯示，ERα轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，抑制了細(xì)胞的生長。推測外源性ERα基因的插入，改變了細(xì)胞中ERα的核漿表達(dá)比例，使細(xì)胞對(duì)于外環(huán)境的應(yīng)答發(fā)生了改變，進(jìn)而影響了細(xì)胞的生長。但增殖曲線的變化不能完全說明ERα的轉(zhuǎn)入對(duì)細(xì)胞生長的影響［6，14］，因?yàn)橥庠椿虻牟迦?，?xì)胞出現(xiàn)過負(fù)荷現(xiàn)象，自身的生長減緩，也會(huì)對(duì)生長曲線產(chǎn)生影響，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明ERα高表達(dá)與細(xì)胞生長的相關(guān)性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了ERα真核表達(dá)載體，使骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中ERα過表達(dá)，并對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生理功能進(jìn)行了初步探討，為ERα和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

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