胡曉豐，史云，戚麗華，王勇，宋宏彬，張傳福，劉雪林

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 疾病預(yù)防控制所，北京 100071

細(xì)菌生物膜（biofilm，BF）是指細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中附著于非生物或生物表面、由自身產(chǎn)生的胞外聚合物及其基質(zhì)網(wǎng)包裹的有三維結(jié)構(gòu)的菌細(xì)胞群體[1]，它可保護(hù)細(xì)菌不受抗菌藥物的作用，并能降低機(jī)體免疫功能和細(xì)胞的吞噬作用[2]。金黃色葡萄球菌是一種重要的致病菌，可引起許多嚴(yán)重感染，現(xiàn)已成為細(xì)菌性食物中毒、醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染最常見(jiàn)的病原菌之一[3]。金黃色葡萄球菌可依靠其黏附在醫(yī)療植入物或組織表面形成生物膜，從而導(dǎo)致生物膜?。╞iofilm associated diseases）的產(chǎn)生[4]。近年來(lái)高分子材料制成的醫(yī)療植入物應(yīng)用廣泛，由于人口老齡化及免疫低下人群的增多，金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的生物膜相關(guān)性疾病患病率逐年上升。至今尚無(wú)藥物能有效控制這類感染，一旦發(fā)生金黃色葡萄球菌生物膜感染，難以徹底治愈。深入研究金黃色葡萄球菌生物膜形成的分子機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)尋找有效的防治、治療藥物和手段具有重要意義。我們就金黃色葡萄球菌生物膜形成過(guò)程、調(diào)控機(jī)制的最新進(jìn)展做簡(jiǎn)要綜述。

1 金黃色葡萄球菌生物膜的形成過(guò)程

金黃色葡萄球菌生物膜的形成過(guò)程大致可分為4個(gè)階段：黏附、聚集、成熟和脫落。金黃色葡萄球菌首先須非特異性黏附于醫(yī)療植入物或組織表面，黏附細(xì)菌在增殖的同時(shí)合成多種胞外多聚物[5]；借助胞外多聚物，細(xì)菌間相互黏附并聚集[6]；而后細(xì)菌生成的生物膜逐漸成熟穩(wěn)定，成熟的生物膜含有胞外多糖黏附分子、蛋白質(zhì)、磷壁酸及胞外DNA等；生物膜成熟后，細(xì)菌合成的酚溶性調(diào)節(jié)肽等物質(zhì)可能介導(dǎo)菌細(xì)胞從生物膜脫落進(jìn)入血流，引起菌血癥或在其他部分引發(fā)新感染灶。在生物膜形成過(guò)程中，金黃色葡萄球菌能夠分泌包括聚集相關(guān)蛋白（Aap）和數(shù)種非共價(jià)結(jié)合的表面蛋白等約20種LPXTG類“識(shí)別黏附基質(zhì)分子的微生物表面組分（microbial sur?face components recognizing adhesive matrix mole?cules，MSCRAMM）”，可與機(jī)體細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如纖維蛋白原等結(jié)合[7-8]。

2 金黃色葡萄球菌生物膜形成的調(diào)控機(jī)制

2.1 胞外多糖黏附因子與金黃色葡萄球菌生物膜的形成

胞外多糖黏附因子（polysaccharide intercelluar adhesion，PIA）是革蘭陽(yáng)性細(xì)菌生物膜基質(zhì)網(wǎng)的重要組成部分，是由相同的單體D-葡萄糖胺通過(guò)β-1，6糖苷鍵相連的不分叉的多聚體。在形成生物膜的金黃色葡萄球菌中，部分菌株的ica操縱子與生物膜形成能力密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，包含一個(gè)調(diào)節(jié)基因icaR和4個(gè)功能基因（依次為icaA、icaD、icaB、icaC）的ica操縱子在生物膜形成等厭氧環(huán)境下基因表達(dá)水平上調(diào)，是生物膜形成所必需的操縱子；icaADBC基因簇的表達(dá)可促進(jìn)PIA的合成，且PIA在金黃色葡萄球菌生物膜形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9-10]。還有研究發(fā)現(xiàn)部分金黃色葡萄球菌ica操縱子陰性，不能形成PIA，但仍可形成生物膜[11]。因此，Archer等[2]提出了PIA依賴的金黃色葡萄球菌生物膜形成途徑和PIA非依賴的金黃色葡萄球菌生物膜形成途徑。

對(duì)于PIA依賴的金黃色葡萄球菌生物膜形成途徑，Jefferson等[12]研究發(fā)現(xiàn)icaR通過(guò)結(jié)合到ica的啟動(dòng)子區(qū)域?qū)ζ溥M(jìn)行了很強(qiáng)的負(fù)調(diào)控，敲除icaR后可導(dǎo)致ica表達(dá)水平增高，而tcaR和icaR是金黃色葡萄球菌的ica基因簇的轉(zhuǎn)錄抑制劑[13]。由此，可通過(guò)tcaR和icaR抑制icaADBC的表達(dá)來(lái)減少PIA的合成，從而減弱生物膜形成的能力。生物膜形成的調(diào)控子Rbf可通過(guò)間接抑制icaR的轉(zhuǎn)錄上調(diào)ica表達(dá)水平，促進(jìn)PIA的生成，從而增強(qiáng)金黃色葡萄球菌生物膜形成的能力[14]；而clpP突變和clpX突變的抑制基因（suppressor of clpP and clpX mutations，Spx）負(fù)調(diào)控金黃色葡萄球菌生物膜形成，通過(guò)間接促進(jìn)icaR轉(zhuǎn)錄來(lái)下調(diào)icaADBC表達(dá)，減少PIA的生成，從而減弱生物膜形成的能力[15]。此外，Ulrich等[16]發(fā)現(xiàn)，雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)SrrB/SrrA通過(guò)結(jié)合到icaADBC操縱子上游100 bp的DNA序列，在厭氧條件下上調(diào)icaADBC操縱子表達(dá)而促進(jìn)PIA的生成。由此可推斷，SrrB/SrrA在厭氧條件下可通過(guò)上調(diào)icaADBC基因簇表達(dá)，促進(jìn)PIA的生成，從而增強(qiáng)PIA依賴的金黃色葡萄球菌生物膜形成的能力。

在PIA非依賴的金黃色葡萄球菌生物膜形成途徑中，主要是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如蛋白A（SpA）和生物膜相關(guān)蛋白（Bap）等發(fā)揮主要作用。Merino等[17]發(fā)現(xiàn)，在ica缺失的金黃色葡萄球菌中，生物膜能夠在SpA缺失突變體中通過(guò)外源加入SpA回補(bǔ)表型形成，說(shuō)明SpA在不錨定到細(xì)胞壁上的情況下仍能增強(qiáng)金黃色葡萄球菌生物膜形成的能力。Lasa[18]等發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌中具有高分子量、位于細(xì)菌表面的Bap和Bap相關(guān)蛋白，可不依賴于PIA而通過(guò)增加細(xì)胞間的聚集促使生物膜形成。此外，纖連蛋白結(jié)合蛋白（FnBP）通過(guò)自溶素和SigB調(diào)節(jié)，也可以促進(jìn)生物膜的形成[19]。值得提出的是，O'Neill等[20]在2007年研究發(fā)現(xiàn)，在把icaADBC操縱子缺失的突變體按照甲氧西林敏感性分類的情況下，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）能夠形成生物膜，而甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）的生物膜形成受損。以上研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白細(xì)胞和細(xì)胞間的黏附能夠以不依賴ica的生物膜形成模式替代PIA依賴的金黃色葡萄球菌生物膜形成，即存在PIA非依賴金黃色葡萄球菌生物膜形成途徑。但對(duì)于ica操縱子缺失的MRSA和MSSA，目前研究人員還不能明確它們形成生物膜能力不同的原因。

2.2 胞外DNA與金黃色葡萄球菌生物膜的形成

金黃色葡萄球菌可通過(guò)多種方式釋放胞外DNA（eDNA），為生物膜形成提供支持。eDNA在金黃色葡萄球菌生物膜形成的初始階段有助于細(xì)菌黏附到有機(jī)物表面及細(xì)菌間黏附，它在金黃色葡萄球菌黏附到高分子多聚物材料表面的初始階段發(fā)揮重要作用。在成熟生物膜中，eDNA作為結(jié)構(gòu)成分對(duì)生物膜起穩(wěn)定作用，它借助其大分子結(jié)構(gòu)，能夠在生物膜中連接其他分子（尤其是蛋白質(zhì)和PIA），從而增強(qiáng)金黃色葡萄球菌生物膜形成能力[7]。

金黃色葡萄球菌eDNA與生物膜形成的調(diào)節(jié)機(jī)制比較復(fù)雜[2]。Whitchurch等[21]首次在銅綠色假單胞菌中發(fā)現(xiàn)eDNA是形成生物膜的重要組分。研究發(fā)現(xiàn)，皮膚細(xì)胞上的DNA酶能減少生物膜形成，通過(guò)DNA酶處理可降解eDNA并減弱eDNA介導(dǎo)生物膜形成的能力[21-23]。金黃色葡萄球菌的cid和lrg操縱子通過(guò)控制細(xì)菌裂解和DNA釋放參與生物膜的形成[24-25]。Rice等[24]發(fā)現(xiàn)，活性基因cidA的缺失可以導(dǎo)致細(xì)菌裂解和生物膜附著的減少，同時(shí)使得這些生物膜中的eDNA量減少。也就是說(shuō)，cidA基因具有裂解細(xì)菌的功能，可導(dǎo)致eDNA釋放增多，從而增強(qiáng)生物膜的形成能力。lrg基因上調(diào)可抑制細(xì)菌自溶，導(dǎo)致eDNA釋放減少，從而減弱金黃色葡萄球菌生物膜的形成能力[25]。cid和lrg操縱子均具有調(diào)節(jié)黏肽水解酶的活性，有研究顯示cid和lrg操縱子編碼蛋白的功能與噬菌體的孔蛋白和孔蛋白拮抗蛋白類似，調(diào)節(jié)細(xì)菌產(chǎn)生的胞壁水解酶活性和細(xì)菌的裂解/死亡，從而影響生物膜的形成。此外，Jeffrey等[26]發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌altA基因編碼的自溶素（AtlA）可能通過(guò)促進(jìn)eDNA的釋放增強(qiáng)生物膜的形成能力。以上研究表明，控制細(xì)胞裂解和eDNA釋放是金黃色葡萄球菌生物膜調(diào)控機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。

2.3 密度信號(hào)感應(yīng)系統(tǒng)與金黃色葡萄球菌生物膜的形成

密度信號(hào)感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing system，QS）是指細(xì)菌細(xì)胞密度依賴的細(xì)胞間信號(hào)基質(zhì)，可以協(xié)調(diào)細(xì)菌特定基因的表達(dá)，有利于細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境壓力。在金黃色葡萄球菌中，輔助基因調(diào)節(jié)（acces?sory gene regulator，agr）系統(tǒng)和 luxS/AI-2系統(tǒng)是目前已發(fā)現(xiàn)的密度信號(hào)感應(yīng)系統(tǒng)中最主要的2個(gè)，并在生物膜形成的不同階段發(fā)揮作用。

2.3.1 agr系統(tǒng) 研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的agr系統(tǒng)通過(guò)上調(diào)解離因子、下調(diào)定殖因子而抑制生物膜的形成[27]。Boles等[28]發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌agr缺失突變株形成生物膜的能力強(qiáng)于其野生型，agr系統(tǒng)促使已建立完整的生物膜解離。此外，向成熟的生物膜中加入自誘導(dǎo)肽（AIP）可以促進(jìn)生物膜解離，這可能是由于agr缺失使得許多參與生物膜解離的基因（如核酸酶、蛋白酶基因等）表達(dá)水平下降導(dǎo)致的。此外，agr系統(tǒng)可以通過(guò)上調(diào)類似去污劑的多肽和核酸酶的表達(dá)來(lái)促進(jìn)生物膜的解離[29]。對(duì)于定殖因子的基因調(diào)控，金黃色葡萄球菌agr系統(tǒng)通過(guò)抑制MSCRAMM表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用[30]。Clp蛋白酶（ClpP）也與生物膜形成有關(guān)，clpP基因敲除后生物膜形成能力增強(qiáng)，agr基因敲除株中ClpP的表達(dá)量顯著提高，提示clpP基因的轉(zhuǎn)錄可能受agr系統(tǒng)的調(diào)控[31]。

2.3.2 luxS/AI-2系統(tǒng) LuxS是細(xì)菌硫代謝中參與甲基循環(huán)的代謝酶之一，催化合成自誘導(dǎo)信號(hào)分子Autoinducer-2（AI-2）。AI-2廣泛存在于大多數(shù)細(xì)菌中，目前被認(rèn)為是惟一能進(jìn)行種內(nèi)和種間交流的“通用語(yǔ)言”[32-33]。對(duì)金黃色葡萄球菌中l(wèi)uxS/AI-2系統(tǒng)功能的研究目前存在爭(zhēng)議，Doherty[34]等在Newman株中敲除了luxS基因，發(fā)現(xiàn)并未影響其毒力和生物膜形成能力，推測(cè)在金黃色葡萄球菌中l(wèi)uxS基因與群體感應(yīng)無(wú)關(guān)；而Kuehl[35]等在Newman株培養(yǎng)基中加入亞抑菌濃度的呋喃酮，發(fā)現(xiàn)luxS的表達(dá)受到抑制，而生物膜形成能力大幅增強(qiáng)。還有研究發(fā)現(xiàn)luxS系統(tǒng)通過(guò)參與調(diào)控金黃色葡萄球菌莢膜多糖的合成來(lái)增強(qiáng)生物膜的形成能力[36]。luxS的代謝作用目前已被證實(shí)[32]，但luxS/AI-2系統(tǒng)在金葡菌生物膜形成中的角色還沒(méi)有被闡釋清楚。

2.4 全局性調(diào)控因子與金黃色葡萄球菌生物膜的形成

目前發(fā)現(xiàn)在金黃色葡萄球菌中調(diào)控生物膜形成的全局性調(diào)控因子（global regulators）包括葡萄球菌輔助調(diào)節(jié)子（staphylococcal accessory regulator A，SarA）、轉(zhuǎn)錄因子sigma B（SigB）等，對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的形成發(fā)揮重要的調(diào)控功能。

2.4.1 輔助調(diào)節(jié)子SarA sarA是除agr外細(xì)胞壁黏附和外毒素等毒力因子的另一個(gè)重要調(diào)控基因，芯片研究發(fā)現(xiàn)sarA至少調(diào)控120個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄[7]。sar操縱子由sarA及3個(gè)啟動(dòng)子（P1、P2、P3）和2個(gè)開(kāi)放讀框（ORF2和ORF4）組成，3個(gè)啟動(dòng)子能夠轉(zhuǎn)錄含重疊區(qū)域的sarA、sarC和sarB轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。sarA通過(guò)抑制核酸裂解和胞外酶來(lái)促進(jìn)黏附和早期的生物膜形成，與浮游態(tài)相比，金黃色葡萄球菌在生物膜狀態(tài)下sarA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平上調(diào)[37]，且sarA缺失突變株形成生物膜的能力減弱[38]。此外，研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌sarA缺失突變株生物膜形成能力可通過(guò)突變耐熱核酸酶或增加蛋白酶抑制劑的基因編碼而恢復(fù)，阻礙了eDNA等生物膜形成重要組分的降解，從而恢復(fù)生物膜形成的能力[39]。

sarA可能以不依賴agr的方式調(diào)控生物膜的形成[40]，而sarA的轉(zhuǎn)錄依賴于sigB[41]。另有研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌PIA的合成必須有sarA存在，它與icaA的啟動(dòng)子序列有很高的親和力，sarA還能正調(diào)控Bap的表達(dá)。此外，在部分金黃色葡萄球菌中，對(duì)受sarA調(diào)控的alsSD基因進(jìn)行突變可影響生物膜的形成能力[7]。

2.4.2 轉(zhuǎn)錄因子SigB SigB可上調(diào)金黃色葡萄球菌生物膜形成早期所必需的因子，包括聚集因子、纖連蛋白結(jié)合蛋白A（FnBPA）和凝固酶[42-43]。除此之外，與生物膜解離相關(guān)的因子，包括β-溶血素、內(nèi)毒素B、絲氨酸蛋白酶（SplA）、半胱氨酸蛋白酶（SplB）、金屬蛋白酶（Aur）、屬半胱氨酸蛋白酶A（SspA）和白細(xì)胞毒素D，都受到SigB的負(fù)調(diào)控[44]。有研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌sigB缺失突變株RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄水平被上調(diào)，且不能形成生物膜[45]；還有研究發(fā)現(xiàn)sigB缺失突變株RN6390失去了形成生物膜的能力，證實(shí)sigB正調(diào)控金黃色葡萄球菌生物膜的形成，并發(fā)現(xiàn)敲除agr或添加蛋白酶抑制劑可以恢復(fù)其形成生物膜的能力[46]；但Valle等[37]發(fā)現(xiàn)sigB的缺失突變株仍然能形成生物膜。根據(jù)這些相反的研究結(jié)果，推測(cè)sigB可能是以一種菌株特異性的形式調(diào)控生物膜的形成。

2.5 雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與金黃色葡萄球菌生物膜的形成

雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（two-component signal transduction systems，TCS）是在原核生物界廣泛存在且保守的一類系統(tǒng)，主要負(fù)責(zé)應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力，調(diào)控細(xì)胞的反應(yīng)。隨著細(xì)菌基因組測(cè)序工作的不斷進(jìn)行，研究人員已在145個(gè)已測(cè)序的細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)了4000多個(gè)TCS，其中金黃色葡萄球菌中存在16對(duì)TCS[47]。目前在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)的與生物膜形成相關(guān)的TCS包括YycG/YycF、SaeS/SaeR、SrrB/SrrA、ArlS/ArlR、LytS/LytR。

金黃色葡萄球菌生存所必需的YycG/YycF的表達(dá)水平與其生物膜形成能力呈正相關(guān)[48-49]。SaeS/SaeR這一TCS參與金黃色葡萄球菌生物膜形成的調(diào)節(jié)[50]，在金黃色葡萄球菌胞外蛋白活化途徑中sae位于agr下游，其突變能上調(diào)agrA表達(dá)，從而影響金黃色葡萄球菌生物膜的形成。SrrB/SrrA于2001年被發(fā)現(xiàn)存在于金黃色葡萄球菌中[51]，它可直接抑制agr系統(tǒng)的作用[52]，在厭氧狀態(tài)下可以刺激金黃色葡萄球菌ica操縱子的轉(zhuǎn)錄及PIA的合成，從而有利于生物膜的形成[53]。ArlS/ArlR是在金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)座突變體的研究中發(fā)現(xiàn)的[54]，金黃色葡萄球菌alsS/R缺失突變株的生物膜形成能力增強(qiáng)[55]。此外，sarA和agr QS系統(tǒng)可對(duì)ArlS/ArlR進(jìn)行調(diào)節(jié)[56]。研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌lytS/R基因缺失突變株的生物膜形成能力增強(qiáng)，表明LytS/LytR在金黃色葡萄球菌生物膜形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[57-58]。

綜上所述，金黃色葡萄球菌生物膜形成過(guò)程和調(diào)控存在錯(cuò)綜復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)，機(jī)制至今未能闡明。因此，需要更加深入探索金黃色葡萄球菌生物膜形成各階段的調(diào)控機(jī)制，從而針對(duì)其生物膜形成的不同環(huán)節(jié)制定不同的抗生物膜策略。

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