石萌 劉小寧 馬紀(jì)

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

利用細(xì)菌表達(dá)dsRNA介導(dǎo)黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白基因的RNA干擾

石萌 劉小寧 馬紀(jì)

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是研究基因功能的一種重要工具。為了利用RNAi技術(shù)對(duì)黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白（Antifreeze protein，AFP）基因的非抗凍功能進(jìn)行驗(yàn)證，將黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白基因Tmafp433的相應(yīng)干擾片段構(gòu)建至L4440干擾載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌HT115（DE3）菌株，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)特異的afp基因相應(yīng)dsRNA，純化后注射黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)afp基因在mRNA水平的變化。結(jié)果顯示含有L4440-Tmafp重組質(zhì)粒的HT115菌株可以表達(dá)干擾afp基因的dsRNA，命名為T(mén)mafp-dsRNA。用Tmafp-dsRNA注射黃粉蟲(chóng)24 h后，Tmafps的表達(dá)受到顯著抑制，相比對(duì)照下降了60.8%。本研究表明通過(guò)注射dsRNA可有效抑制黃粉蟲(chóng)afp基因的表達(dá)。

黃粉蟲(chóng) 抗凍蛋白基因 RNA干擾 雙鏈RNA L4440載體

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指內(nèi)源或外源雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘導(dǎo)的靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默的現(xiàn)象，在1998年由Fire等人首次證實(shí)［1］。隨后RNAi被廣泛用于基因功能、基因治療研究等多個(gè)領(lǐng)域。在昆蟲(chóng)中，RNAi首先被用于研究模式昆蟲(chóng)果蠅［2］，隨后在鱗翅目、鞘翅目、直翅目、膜翅目等多種昆蟲(chóng)中得到廣泛應(yīng)用［3］。RNAi可作為一種有力的工具來(lái)研究昆蟲(chóng)基因功能或進(jìn)行害蟲(chóng)控制。

進(jìn)行RNAi的方式可分為細(xì)胞內(nèi)RNAi和細(xì)胞外RNAi［4］。細(xì)胞內(nèi)RNAi多通過(guò)浸染、電穿孔或顯微注射的方式將dsRNA直接導(dǎo)入細(xì)胞；而細(xì)胞外RNAi則通過(guò)浸泡、飼喂或注射進(jìn)行dsRNA的遞送，需要依靠細(xì)胞攝取dsRNA。利用RNAi技術(shù)研究昆蟲(chóng)基因功能多以飼喂混有dsRNA的人工飼料［5］或注射dsRNA［6］的方式進(jìn)行。飼喂方法簡(jiǎn)便，成本低，但由于多數(shù)昆蟲(chóng)對(duì)飼喂的dsRNA不敏感，不能誘發(fā)RNAi效應(yīng)，如東亞飛蝗（Locusta migratoria）［7］等。注射法直接將dsRNA注入昆蟲(chóng)的血腔中，進(jìn)而誘發(fā)RNAi，因此普遍用于昆蟲(chóng)基因功能的研究［3，8］。對(duì)鞘翅目昆蟲(chóng)多采用幼蟲(chóng)注射法導(dǎo)入體外轉(zhuǎn)錄合成的dsRNA。通過(guò)將目的基因的干擾片段構(gòu)建至L4440 dsRNA表達(dá)載體后轉(zhuǎn)化RNase-III缺陷型的大腸桿菌HT115（DE3）菌株，可誘導(dǎo)表達(dá)相應(yīng)的dsRNA。王根洪等［9］通過(guò)提取細(xì)菌表達(dá)的dsRNA注射家蠶（Bombyx mori），成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)FTZ-F1基因的RNA干擾。

抗凍蛋白（Antifreeze protein，AFP）是一類(lèi)能抑制冰晶生長(zhǎng)的特殊蛋白質(zhì)。它可降低溶液的冰點(diǎn)，而不改變?nèi)埸c(diǎn)，導(dǎo)致熔點(diǎn)和冰點(diǎn)之間出現(xiàn)差值，即熱滯活性［10］，從而增強(qiáng)昆蟲(chóng)的耐寒性?？箖龅鞍拙哂幸种浦亟Y(jié)晶、維持體液過(guò)冷卻等多種功能。然而，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，鞘翅目擬步甲科的小胸鱉甲抗凍蛋白具有熱保護(hù)作用［11］，高溫和干旱都能誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。因此，抗凍蛋白除了具有抑制冰晶生長(zhǎng)的功能外，可能還具有其他非抗凍的保護(hù)功能，為了全面研究抗凍蛋白的功能，本研究以同為擬步甲科的黃粉蟲(chóng)（Tenebrio molitor）為研究對(duì)象，利用其飼養(yǎng)成熟、來(lái)源豐富、抗凍蛋白熱滯活性高的特點(diǎn)，構(gòu)建基因干擾載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)dsRNA，然后注射黃粉蟲(chóng)，結(jié)果顯示所設(shè)計(jì)的dsRNA能夠干擾黃粉蟲(chóng)afp基因的表達(dá)，為進(jìn)一步驗(yàn)證afp基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試蟲(chóng)來(lái)源 黃粉蟲(chóng)購(gòu)自烏魯木齊市南園花卉市場(chǎng)，飼養(yǎng)于恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)。飼養(yǎng)溫度（25± 0.5）℃，相對(duì)濕度（30±6）%，光周期16L∶8D。以麥麩為主要飼料，2 d喂食一次卷心菜葉補(bǔ)充水分。

1.1.2 主要試劑 SYBR Green Supermix kit、TRizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，Taq酶、DNase I、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、Oligo（dT）、Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）、DNA Marker、 pMD18-T、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa），SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒及DEPC購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，感受態(tài)細(xì)胞菌種DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，L4440載體和大腸桿菌HT115菌株為本實(shí)驗(yàn)室保藏，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。引 物 合 成 和 測(cè) 序 由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白基因干擾載體的構(gòu)建 根據(jù)黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白基因Tmafp433（GenBank號(hào)AF160497）序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增afp基因的RNA干擾片段（408 bp）的引物，上下游引物分別帶有BglII和PstI酶切位點(diǎn)。序列分別為afp F1：AGATCTTGGTTAATTATAGCAGTTATCGTTATG TG；afp R1：CTGCAGTCCGGGACATCCTGTT（下劃線表示添加的酶切位點(diǎn)）。以前期構(gòu)建的pMD18-TTmafp433質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；產(chǎn)物在4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（記為T(mén)mafp片段），連接pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，涂布含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)12 h后，挑取陽(yáng)性克隆于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌液PCR鑒定；并提取重組質(zhì)粒用BglII和PstI進(jìn)行酶切鑒定，將鑒定正確的pMD18T-Tmafp重組子送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將鑒定正確的pMD18T-Tmafp重組質(zhì)粒與L4440干擾載體分別同時(shí)用BglII和PstI進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，用T4連接酶于16℃連接，獲得L4440-Tmafp重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽(yáng)性單克隆于LB含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并進(jìn)行菌液PCR及質(zhì)粒雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。將L4440-Tmafp重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至采用CaCl2法制備的HT115感受態(tài)細(xì)胞中，在氨芐青霉素和四環(huán)素抗性的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆，并通過(guò)PCR及雙酶切進(jìn)行鑒定。構(gòu)建過(guò)程如圖1所示。

1.2.2 黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白基因dsRNA的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 試驗(yàn)以果蠅白眼基因的dsRNA（片段大小為421 bp）作為無(wú)關(guān)dsRNA對(duì)照（記為W-dsRNA），其干擾載體為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，經(jīng)PCR及酶切鑒定后，活化菌種直接誘導(dǎo)表達(dá)。參照胡有燕［12］、王根洪等［9］的方法原核表達(dá)W-dsRNA和Tmafp-dsRNA，并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。將攜帶L4440-Tmafp及L4440-W質(zhì)粒的HT115菌液接種于氨芐青霉素和四環(huán)素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)12 h后，按1%接種于液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)菌液至OD600=0.4左右，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。37℃振蕩培養(yǎng)4 h后，于4℃，4 000 r/min離心3 min，收集菌體，采用TRIzol法提取細(xì)菌總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)菌總RNA。然后分別利用DNaseI和RNaseA消化細(xì)菌總RNA各30 min［13］，再用三氯甲烷抽提，異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌后晾干，溶于DEPC處理水中，并利用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)（NanoDrop Technologies，Wilmington，USA）檢測(cè)dsRNA濃度。-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白基因的RNA干擾 選取生長(zhǎng)一致的末齡黃粉蟲(chóng)隨機(jī)分為4組，用10 μL微量進(jìn)樣器注射dsRNA，每組60頭幼蟲(chóng)。第1組為試驗(yàn)組，每頭幼蟲(chóng)注射5 μg（1 μg/μL）TmafpdsRNA；第2組為無(wú)關(guān)dsRNA對(duì)照組，每頭幼蟲(chóng)注射5 μg（1 μg/μL）W-dsRNA；第3組為空白對(duì)照組，每頭幼蟲(chóng)注射5 μL PBS緩沖液；第4組不作任何處理。RNAi后于正常條件下繼續(xù)飼養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)各組黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)的死亡率。注射24 h后TRIzol法提取各組黃粉蟲(chóng)的總RNA，并反轉(zhuǎn)為cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)黃粉蟲(chóng)afp基因的表達(dá)。每組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行取2只幼蟲(chóng)提取RNA。黃粉蟲(chóng)afp基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物為：afpF2：AGCAGTTATCGTTATGTGTTTGTGT；afpR2：GGTACACGTTATTGCATTTGGAC；以黃粉蟲(chóng)18S基因作為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物為：18S F：TCAGATACCGCCCTAGTTCTAACCA；18S R：TCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGC。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)按帶有ROX的Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG的使用說(shuō)明進(jìn)行。取等量cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。于GeneAmp Thermal Cycler 7500中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，程序?yàn)椋?0℃ 2 min；95℃ 3 min；95℃ 10 s，58℃30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCT法。afp基因表達(dá)量是與內(nèi)參基因相比的相對(duì)表達(dá)量，并以未處理的對(duì)照組進(jìn)行歸一化處理。采用醫(yī)學(xué)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 4.0中的單因素方差分析和Turkey多重比較分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白基因干擾載體的構(gòu)建

2.1.1 含有BglII和PstI酶切位點(diǎn)的Tmafp433基因干擾片段的克隆 黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白基因存在眾多亞型，編碼小分子蛋白質(zhì)，基因序列較短?？紤]到長(zhǎng)片段dsRNA比短片段dsRNA更容易誘發(fā)RNAi［14，15］，因此選擇序列相對(duì)較長(zhǎng)的Tmafp433基因。Tmafp433基因的ORF序列長(zhǎng)度為447 bp，編碼148個(gè)氨基酸，含有7個(gè)擬步甲科昆蟲(chóng)抗凍蛋白特有的“TCTXSXXCXXAX”重復(fù)序列。通過(guò)在線預(yù)測(cè)（http：//bioinfo. clontech.com/rnaidesigner/sirnaSequenceDesign.do） 潛在的RNAi靶序列發(fā)現(xiàn)在其33-423 bp的位置存在22個(gè)可能的干擾靶位點(diǎn)，所以選擇了包含這些潛在靶位點(diǎn)的408 bp序列作為干擾片段。

以前期構(gòu)建的pMD18T-Tmafp433質(zhì)粒為模板，用afp F1/F2引物PCR擴(kuò)增預(yù)期大小為420 bp的片段。電泳結(jié)果（圖2-A）顯示，擴(kuò)增片段位于接近500 bp的位置，與預(yù)期大小一致。將目的片段回收連接至pMD18-T載體上，對(duì)重組子進(jìn)行酶切鑒定（圖2-B）并測(cè)序，證實(shí)序列正確。

2.1.2Tmafp433基因干擾載體的構(gòu)建及鑒定 將pMD18T-Tmafp重組質(zhì)粒與L4440載體質(zhì)粒雙酶切（BglII/PstI），回收后連接（圖3-A）。重組子經(jīng)菌液PCR檢測(cè)，得到一條大小接近500 bp的條帶（圖3-B），與預(yù)期相符。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后得到一條約2 700 bp和一條約500 bp的條帶（圖3-C），與目的片段及線性L4440質(zhì)粒片段大小一致，表明Tmafp433基因干擾片段已構(gòu)建至L4440載體上。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，證實(shí)構(gòu)建正確。

2.2 Tmafp-dsRNA 和W-dsRNA的誘導(dǎo)表達(dá)

分別對(duì)含有L4440-Tmafp和L4440-W重組質(zhì)粒的HT115菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在OD600為0.4時(shí)加入IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）誘導(dǎo)，37℃培養(yǎng)4 h。提取誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后的菌體總RNA，結(jié)果顯示，攜帶 L4440-Tmafp（圖4-A）和L4440-W（圖4-B）質(zhì)粒的HT115在誘導(dǎo)后均在分子量接近500 bp的位置多出現(xiàn)一個(gè)與預(yù)期dsRNA片段大小一致的條帶，如箭頭所示。用DNase I和RNase A對(duì)誘導(dǎo)后的總RNA進(jìn)行消化，電泳檢測(cè)顯示菌體DNA及RNA被降解，僅在誘導(dǎo)后出現(xiàn)多余條帶的位置殘余一個(gè)條帶，據(jù)此判定攜帶L4440-Tmafp和L4440-W的HT115菌液誘導(dǎo)后出現(xiàn)的特異條帶分別為T(mén)mafpdsRNA及W-dsRNA，表明可通過(guò)細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)Tmafp-dsRNA及W-dsRNA。

2.3 抗凍蛋白基因干擾后黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)的死亡率統(tǒng)計(jì)

對(duì)黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)注射PBS、W-dsRNA和TmafpdsRNA后均出現(xiàn)不同程度的死亡（圖5）。其中注射PBS和W-dsRNA后黃粉蟲(chóng)在24 h時(shí)即出現(xiàn)少量死亡，之后死亡率不再增加，與未注射對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，推測(cè)黃粉蟲(chóng)的死亡是由注射造成。而注射Tmafp-dsRNA后黃粉蟲(chóng)的死亡率呈上升趨勢(shì)，在48 h達(dá)到最高，為9.12%，和其他處理組均有顯著差異（P＜0.05）。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白基因干擾后的表達(dá)

為了檢測(cè)注射Tmafp-dsRNA是否會(huì)抑制黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白基因的表達(dá)，對(duì)注射24 h后的dsRNA處理組和對(duì)照組的黃粉蟲(chóng)cDNA樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果（圖6）顯示，注射Tmafp-dsRNA組的TmafpmRNA水平的相對(duì)表達(dá)量顯著低于3個(gè)對(duì)照組，即未注射組（control）、注射PBS組和注射W-dsRNA組。其中注射Tmafp-dsRNA后黃粉蟲(chóng)的afp相對(duì)表達(dá)量相比未注射組下降了60.8%，表明細(xì)菌表達(dá)的Tmafp-dsRNA可顯著抑制黃粉蟲(chóng)afp基因的表達(dá)。而注射PBS和W-dsRNA試驗(yàn)組的afp表達(dá)量顯著高于未注射組，分別上升了43.7%和39.1%，推測(cè)可能是注射對(duì)黃粉蟲(chóng)產(chǎn)生了刺激，從而引起afp基因的上調(diào)表達(dá)。

3 討論

本研究構(gòu)建了干擾黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白基因afp的dsRNA，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)dsRNA并進(jìn)行純化，通過(guò)對(duì)黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)注射dsRNA，抑制了黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白基因Tmafp的表達(dá)?？箖龅鞍谆蚓幋a的小分子蛋白質(zhì)對(duì)提高昆蟲(chóng)耐寒性具有重要作用，被認(rèn)為是許多昆蟲(chóng)重要的越冬策略［16］。由于新近發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白具有抗凍之外的其他功能［11］，因此抗凍蛋白R(shí)NA干擾質(zhì)粒的成功構(gòu)建表達(dá)，有助于進(jìn)一步研究其功能?？箖龅鞍谆蚴且粋€(gè)超基因家族，存在眾多亞型。擬步甲科昆蟲(chóng)抗凍蛋白具有特殊的“TCTXSXXCXXAX”（其中X為任意氨基酸）重復(fù)序列，其數(shù)目不同構(gòu)成不同的異構(gòu)體（isoform），故保守性較高［17］。對(duì)黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白基因Tmafp433（AF160497）序列分析發(fā)現(xiàn)，其與黃粉蟲(chóng)其他afp基因具有81%-99%的一致性（identity），所以Tmafp433基因相應(yīng)的dsRNA有可能沉默所有Tmafp基因的表達(dá)。這對(duì)于通過(guò)RNAi研究抗凍蛋白的功能非常有利。根據(jù)Tmafp433的ORF序列在線預(yù)測(cè)了可能存在的siRNA位點(diǎn)，選擇其中408 bp序列作為RNA干擾片段，并加入BglII和PstI兩個(gè)酶切位點(diǎn)，以便構(gòu)建至L4440干擾載體。此外，我們?cè)邳S粉蟲(chóng)afp基因5'端高度保守的信號(hào)肽編碼區(qū)域設(shè)計(jì)了實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，可以檢測(cè)RNA干擾后黃粉蟲(chóng)體內(nèi)afp基因家族的表達(dá)水平。

L4440干擾載體含有兩個(gè)相反方向的T7聚合酶啟動(dòng)子及l(fā)ac乳糖操縱子，可通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)dsRNA。大腸桿菌HT115（DE3）菌株為dsRNA特異的核酸內(nèi)切酶（RNase III）缺陷型菌株［18］，利用L4440載體構(gòu)建的L4440-Tmafp 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化HT115（DE3）菌株，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了特異dsRNA的表達(dá)。為獲得純度較高的dsRNA，對(duì)提取的誘導(dǎo)后細(xì)菌總RNA進(jìn)行消化。其中利用DNase I消化總RNA中的單鏈或雙鏈DNA而不影響單鏈或雙鏈RNA，利用RNase A可特異性攻擊RNA上嘧啶殘基的3'端，切割與相鄰核苷酸形成的磷酸二酯鍵［19］，而對(duì)雙鏈的DNA和RNA不起作用的特性來(lái)消化RNA，從而達(dá)到純化dsRNA的目的。

黃粉蟲(chóng)經(jīng)PBS、W-dsRNA和Tmafp-dsRNA注射后均出現(xiàn)死亡，其中PBS和W-dsRNA注射組的死亡率顯著低于Tmafp-dsRNA注射組，而與未注射組無(wú)差異，這可能是由于注射對(duì)黃粉蟲(chóng)造成傷害，從而導(dǎo)致死亡。注射Tmafp-dsRNA后黃粉蟲(chóng)的死亡率較高，可能一方面是由于注射導(dǎo)致，另一方面則是因?yàn)門(mén)mafp-dsRNA誘發(fā)RNAi，抑制了黃粉蟲(chóng)afp基因的表達(dá)，影響了其正常的生理代謝。RNAi的效果因物種不同、靶基因不同或dsRNA的遞送方式不同而不同。如對(duì)長(zhǎng)紅獵蝽（Rhodnius prolixus）注射15 μg dsRNA可降低（75±14）%的唾液腺攜帶亞鐵紅素蛋白2基因表達(dá)，而飼喂13 μg dsRNA則僅降低基因（42±10）%的表達(dá)［20］。在鞘翅目昆蟲(chóng)赤擬谷盜（Tribolium castaneum）［21］、玉米根螢葉甲（Diabrotica virgifera virgifera）［22］等昆蟲(chóng)中均通過(guò)注射dsRNA的方式取得很好的RNAi效果。而通過(guò)對(duì)黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)注射純化后的Tmafp-dsRNA，檢測(cè)Tmafp基因mRNA水平的變化時(shí)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)受到顯著抑制，比為注射組下降了60.8%，表明所合成的Tmafp-dsRNA可有效地發(fā)揮干擾作用。對(duì)擬步甲科的赤翅甲（Dendroides canadensis）afp基因沉默后，其熱滯活性顯著降低［23］，而昆蟲(chóng)熱滯活性的高低與其耐寒性密切相關(guān)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，對(duì)黃粉蟲(chóng)注射PBS和W-dsRNA后，其afp表達(dá)量顯著高于未注射組，類(lèi)似的情況在赤翅甲中也有發(fā)現(xiàn)［23］，這可能是由于注射對(duì)黃粉蟲(chóng)造成傷害，引起了黃粉蟲(chóng)的應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致afp基因的上調(diào)表達(dá)，這與我們發(fā)現(xiàn)荒漠甲蟲(chóng)抗凍蛋白基因表達(dá)受環(huán)境因素脅迫誘導(dǎo)具有一致性［11，24，25］。這也許提示抗凍蛋白在體內(nèi)具有應(yīng)急響應(yīng)功能，因此我們對(duì)抗凍蛋白功能的認(rèn)識(shí)還十分有限。抗凍蛋白基因在昆蟲(chóng)受到干旱、熱激等非生物脅迫時(shí)表現(xiàn)的上調(diào)表達(dá)［11，26］，提示抗凍蛋白可能與昆蟲(chóng)抵抗環(huán)境脅迫有密切關(guān)系。

4 結(jié)論

利用大腸桿菌HT115特異表達(dá)了黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白基因Tmafp433相應(yīng)的dsRNA，經(jīng)提取純化后注射黃粉蟲(chóng)，對(duì)其afp基因進(jìn)行RNA干擾。結(jié)果表明細(xì)菌表達(dá)的Tmafp-dsRNA對(duì)黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白基因的表達(dá)具有明顯的抑制作用，這為大規(guī)模干擾黃粉蟲(chóng)afp基因，詳細(xì)研究其功能奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)有利于進(jìn)一步開(kāi)展afp基因與昆蟲(chóng)非生物脅迫的關(guān)系研究。

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（責(zé)任編輯 李楠）

RNA Interference of Antifreeze Protein Gene in Tenebrio molitor Mediated by Bacterially Expressed dsRNA

Shi Meng Liu Xiaoning Ma Ji
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

In order to further study the non-freezing function of antifreeze protein（AFP）genes in Tenebrio molitor using RNAi technology, the RNAi fragment of Tmafp433 from T. molitor was inserted into L4440 dsRNA expression vector, and transformed into E. coli HT115（DE3）. The dsRNA corresponding to Tmafps, designated as Tmafp-dsRNA, was expressed by IPTG induction, and injected into the larvae after purification. The mRNA level of Tmafps was detected using real-time quantitative PCR. The results showed that the E. coli HT115（DE3）containing L4440-Tmafp recombinant plasmid can express Tmafp-dsRNA. After 24 h of injection, the expression of Tmafps in T. molitor was significantly decreased to 60.8% of the control, suggesting that the expression of Tmafps was inhibited by injecting the bacterially expressed Tmafp-dsRNA. The present results laid foundation for further research in afp gene function.

Tenebrio molitor afp gene RNA interference Double-stranded RNA L4440 vector

2014-01-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31360527），新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（XJDX0201-2014-03）

石萌，女，碩士研究生，研究方向：昆蟲(chóng)分子生物學(xué)；E-mail：12721464@qq.com

馬紀(jì)，博士，教授，研究方向：昆蟲(chóng)低溫分子生物學(xué)；E-mail：majiuci@xju.edu.cn