王燕+曾燏

王 燕1 曾 燏2

1.川北醫(yī)學院病原生物與免疫學教學實驗中心，四川南充 637000；

2.西華師范大學生命科學院，四川南充 637002

[摘要] 目的 比較細菌在不同培養(yǎng)基和不同菌齡條件下鞭毛的染色效果，探索細菌鞭毛染色形態(tài)鑒定理想的培育基和培育時間。 方法 ①將普通變形桿菌分別接種在肉湯培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基3種不同培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)18 h后，染色鏡檢，選擇取出染色效果最好的理想培養(yǎng)基；②將普通變形桿菌接種到理想培養(yǎng)基上分別培育8、12、18、24 h不同時間后，染色鏡檢，選擇出細菌鞭毛染色效果最好的培育時間。 結(jié)果 ①血瓊脂中培養(yǎng)的細菌鞭毛結(jié)構(gòu)清晰、形態(tài)完整、背景干凈，鏡檢效果最好；②12～18 h菌齡的細菌菌體中等大小，鞭毛清晰完整，鏡檢效果好。 結(jié)論 血瓊脂是鞭毛染色教學和形態(tài)鑒定理想的培養(yǎng)基；12～18 h是細菌在血瓊脂培養(yǎng)基中的最佳生長時間。

[關鍵詞] 鞭毛染色；培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間；鍍銀染色；普通變形桿菌

[中圖分類號] R446 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）03（b）-0035-03

The study of culture conditions in bacterial flagella staining

WANG Yan1 ZENG Yu2

1.Experimental Teaching Center for Pathogenic Subject， North Sichuan Medical University， Sichuan Province， Nanchong 637000， China； 2.College of Life Science， China West Normal University， Sichuan Province， Nanchong 637002， China

[Abstract] Objective To compare the bacterial flagella staining effect in different medium and different age conditions， and to explore the best medium and incubation time for bacterial flagella staining teaching and morphological identification. Methods ①The Proteus vulgaris were inoculated in broth medium， agar medium， and blood agar medium 3 different media， cultured for 18 hours based on 37℃， then stained and checked with the microscopic， and the best medium was chosen. ②The Proteus vulgaris were inoculated into the ideal medium culture for 8， 12， 18， 24 h respectively， then stained and checked with microscopic， and the best time of cultivation in flagella staining effect was selected. Results ①The bacterial growth on blood agar had good results， with complete structure， clear morphological and clean background. ②12-18 hours age had the best effect with clear and complete flagella. Conclusion The blood agar is the best medium for bacterial flagella staining teaching and morphological identification. Meanwhile， the best time of bacteria in culture is 12-18 hours.

[Key words] Flagella staining； Media and incubation time； Silver staining； Proteus vulgaris

細菌鞭毛是指存在于細菌細胞壁外的呈波浪彎曲的細長絲狀物，是細菌的運動器官。細菌鞭毛在不同細菌中的著生位置和數(shù)量是不一樣的，是細菌種類鑒定和分類的重要依據(jù)之一[1-4]。細菌的鞭毛非常纖細，長5～20 μm，直徑僅10～20 nm，小于光學顯微鏡的0.2 μm的分辨率，因此，鞭毛需經(jīng)過增粗直徑后再染色才能在光學顯微鏡下觀察[5]。鞭毛的染色效果與細菌的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基的類型密切相關，如劉少有等[6]發(fā)現(xiàn)嗜肺軍團菌在BCYE培養(yǎng)基上生長的鞭毛較NYE培養(yǎng)基中數(shù)量多、生長好；謝文熙[7]研究結(jié)果表明，8～12 h為細菌鞭毛染色的最佳觀察時間。

普通變形桿菌（proteus vulgaris），廣泛分布于自然界，為周鞭毛菌，易于觀察，是細菌鞭毛教學和實驗的理想菌種之一。鞭毛染色步驟繁瑣且結(jié)果不穩(wěn)定，不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對細菌鞭毛的染色效果影響很大，如何選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是細菌鞭毛形態(tài)學研究的熱點問題之一[8-11]。同時由于操作過程復雜，影響因素多，成功率偏低，使得鞭毛染色在基礎醫(yī)學教學中往往較難取得預期的效果。因此，本研究以普通變形桿菌為菌種，通過常規(guī)染色方法（鍍銀染色法）來比較普通變形桿菌在不同培養(yǎng)基（基礎肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)）和不同培育時間（8、12、18、24 h）下的鞭毛染色效果，探討適宜普通變形桿菌鞭毛培育的最佳條件（培養(yǎng)基和培育時間），以提高鞭毛染色的成功率，從而更好地服務于基礎醫(yī)學的實驗教學。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種為普通變形桿菌，保存于川北醫(yī)學院病原生物與免疫學教學實驗中心。實驗中所用的試劑： 肉浸膏、蛋白胨、瓊脂粉購于杭州天和微生物試劑有限公司；NaCl、FeCl3購于成都科龍化工試劑廠；硝酸銀購于天津市博迪化工有限公司；兔血來源于川北醫(yī)學院動物中心；培養(yǎng)箱購于上海精宏實驗設備有限公司（型號為SHP-250）。

1.2 培養(yǎng)基[12]

1.2.1 基礎肉湯培養(yǎng)基 于1000 mL蒸餾水中加入固體物質(zhì)，包括3.0 g肉浸膏，10.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，1000 ml蒸餾水，混合加熱溶解；校正pH至7.4～7.6，煮沸3～5 min，用濾紙過濾；分裝于適當試管內(nèi)，121℃高壓蒸汽滅菌20 min后，置陰暗處貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基礎瓊脂培養(yǎng)基 于基礎肉湯培養(yǎng)基中加入15%的瓊脂粉，121℃高壓蒸汽滅菌20 min后倒入平板上冷卻待用。

1.2.3 血瓊脂培養(yǎng)基 將已滅菌的普通瓊脂培養(yǎng)基加熱融化，待其冷卻至50℃左右，在無菌條件下加入脫纖維兔血5%～10%，輕搖勻（勿使有氣泡）后倒入平板上冷卻待用。

1.3 菌種

從菌種庫取出普通變形桿菌，采用點接法將細菌接種于基礎培養(yǎng)基平板上，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱里連續(xù)培養(yǎng)18～24 h，后再轉(zhuǎn)接于另一新鮮平板培養(yǎng)基中繼續(xù)培育，如此重復培育3代（次）后備用。

1.4 染液制作

媒染劑A[13]：3.0 g FeCl3·6H2O，溶于0.01 mol/L的HCl溶液100 mL中，室溫存放，長期穩(wěn)定。

媒染劑B[13]：單寧酸15.0 g溶解于100 mL蒸餾水中，加入37%甲醛1.0 mL。室溫存放，長期穩(wěn)定。

銀染液C[14]：AgNO3 5.0 g溶于100 mL蒸餾水，取出10.0 mL備用，向余下的90 mL硝酸銀溶液緩慢滴加濃氨水，邊加邊搖動，直至形成沉淀完全溶解重新形成澄清液為止，再將備用的AgNO3溶液緩慢回滴，直至形成穩(wěn)定薄霧狀溶液。

1.5 載玻片處理

將新載玻片放入洗衣粉水清潔液中煮沸10 min，取出冷卻后用自來水沖洗干凈，再用清潔液浸泡煮沸10 min，自來水沖洗干凈。使用前放入95%酒精浸泡24 h，用時取出用紗布擦干。

1.6 染色方法

1.6.1 細菌培養(yǎng) ①將傳代后的普通變形桿菌分別以液體培養(yǎng)基接種法接種于肉湯管，點接法接種于基礎瓊脂平板和點接法接種于血瓊脂平板內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，經(jīng)染色鏡檢后，選取染色效果最好的培養(yǎng)基。②將傳代的普通變形桿菌接種于染色效果最好的培養(yǎng)基上（隨機接種3份），分別在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8、12、18、24 h后染色鏡檢，確定染色效果最好的培育時間。

1.6.2 制片 于處理過的載玻片一端滴加2～3滴蒸餾水，用接種環(huán)以無菌操作法取菌落邊緣細菌一環(huán)，懸于蒸餾水中，待水滴稍變渾濁后立即移開接種環(huán)，靜置5 min讓鞭毛舒張開來，稍傾斜玻片，使菌液從玻片的一端流向另一端，放置臺上，自然干燥。

1.6.3 染色 取A液1 mL滴入帶有塞的試管內(nèi)，再加入B液1 mL，充分混合，用酒精燈火焰微熱20 s，稍冷卻后取適量混合液滴于制片好的菌膜上并完全覆蓋菌膜染50 s，用蒸餾水沖洗干凈。因A、B混合物不穩(wěn)定，故要盡快使用，否則影響染色效果。

滴加銀染液C覆蓋住菌膜，加熱至蒸氣微冒（約持續(xù)20 s），用蒸餾水沖洗干凈，并保證染液不被蒸干。

1.7 鏡檢觀察

用吸水紙吸干已染色好的載玻片，后在顯微鏡（油鏡）下鏡檢、觀察、拍照。為了避免實驗誤差，每次實驗均在同等條件下重復3次，不同批次所得的染色玻片均由同一人進行鏡檢觀察。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基對細菌鞭毛染色效果的影響

分別比較接種于3種不同培育基（普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基和普通血瓊脂培養(yǎng)基）上普通變形桿菌鞭毛的鏡檢效果可知，在血瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細菌鞭毛伸展性好，菌體形態(tài)完整，粗細均勻，總體效果好，而普通肉湯培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)的鞭毛較稀疏，結(jié)果則相對較差。

2.2 菌種培育時間對細菌鞭毛染色效果的影響

培養(yǎng)時間長短對普通變形桿菌的鞭毛生長也有較大影響。將普通變形桿菌接種在培育效果較好的血瓊脂培養(yǎng)基中培育，分別培養(yǎng)8、12、18、24 h，比較不同的培養(yǎng)時間下普通變形桿菌的鏡下效果：8 h菌齡的細菌菌體粗大且很長、鞭毛周身如毛絨狀，這可能是變形桿菌菌體還處于分裂繁殖階段，而鞭毛也正在發(fā)育；12 h菌齡細菌菌體中等大小，鞭毛清晰完整，效果好；18 h菌齡的細菌菌體較短小，鞭毛周身且完整，易于觀察，24 h菌齡細菌菌體短小，鞭毛比較稀疏，有些菌體的鞭毛已脫落。因此選用12～18 h菌齡的細菌做鞭毛染色效果好，易于觀察。見圖1。

a：8 h；b：12 h；c：18 h；d：24 h

圖1 培養(yǎng)不同時間的細菌鞭毛染色圖（1000×）

3 討論

鞭毛染色步驟較多、過程復雜，影響其染色效果的因子較多，且難以量化，使得細菌的鞭毛染色歷來被認為是難點多、不易掌握的一種方法。筆者結(jié)合本研究結(jié)果及工作實踐中的多次試驗，不斷總結(jié)，就如何提高細菌鞭毛染色效果提出以下建議和注意事項：①載玻片要處理干凈，不能有油漬，否則細菌游動不開堆積在一起，無法進行觀察。較好的玻片標準：當?shù)渭右坏握麴s水在上面時，水滴能快速均勻的擴散開來。②在平板上接種細菌采用點接法，一般一個平板點接3處。③培養(yǎng)時間要掌握好，一般培養(yǎng)時間控制在12～18 h內(nèi)，若時間太短，剛形成的鞭毛較小，且菌體較粗大不利于觀察鞭毛，若時間太長則鞭毛易脫落也不利于觀察。④制片時，應選取菌落邊緣的幼齡菌，且接種環(huán)應先放入載玻片上的蒸餾水中靜置待用，當細菌游動開來再拿出，切忌用涂抹法制片，否則易造成鞭毛脫落。⑤制得的片子只能自然干燥，不能加熱固定，否則細菌變形后鞭毛脫落不利于觀察。⑥染液A、B混合時要掌握好時間，且混合后盡快使用，不可久置，特別注意每一步染色后均需用蒸餾水進行充分地漂洗，否則背景雜質(zhì)顆粒，不利于觀察。⑦用銀染液染色時要加熱，且加熱過程中應及時添加染液，保證染液不干涸。

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（收稿日期：2013-12-01 本文編輯：任 念）

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（收稿日期：2013-12-01 本文編輯：任 念）

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（收稿日期：2013-12-01 本文編輯：任 念）