郄霜，張慶波，馮曉燕

1.軍事醫(yī)學科學院 基礎醫(yī)學研究所，北京 100850；2.河北聯(lián)合大學，河北 唐山 063000

結核病是人類最古老的傳染病之一，至今依然是單一感染因素引起死亡人數(shù)最多的疾病。我國是全球22個結核病高負擔國家之一，結核病發(fā)病人數(shù)居世界第二，結核病報告發(fā)病人數(shù)始終位居法定報告甲、乙類傳染病前列[1]。因此，對結核病患者實行早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，一直是結核病研究工作的重點。

目前結核病的診斷方法主要有細菌學檢測、皮膚試驗、細胞因子檢測、抗酸檢測、抗原和抗體檢測等，但這些方法存在著耗時較長、對樣本的保存條件要求較高或檢出率不高等缺陷，一直困擾著結核病的診斷和治療。研究發(fā)現(xiàn)，一些microRNA（miRNA）能穩(wěn)定地存在于結核病患者的血清中，部分miRNA表達會發(fā)生上調或下調[2]，可作為診斷結核病的依據(jù)。另外，在結核病患者的痰液中也存在能夠被檢測出的miRNA[3]，該項研究的發(fā)現(xiàn)為臨床早期診斷提供了新的思路。

1 miRNA及其生物學功能

miRNA是近年來在多種真核細胞及病毒中發(fā)現(xiàn)的一類來源于內源性染色體的非編碼單鏈調節(jié)RNA，長度約為22（18～25）個核苷酸，是由一段具有發(fā)夾環(huán)結構的長度為70～80核苷酸的單鏈RNA前體剪切后生成的短序列。miRNA以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中，而且絕大部分定位于基因間隔區(qū)，其轉錄獨立于其他基因，并不翻譯成蛋白質，而是通過阻遏或降解相應的mRNA使蛋白質的表達水平發(fā)生變化，從而在體內代謝過程中起到多種調控作用[4]。

在感染性疾病中，人們發(fā)現(xiàn)感染的病毒或細菌能夠通過基因沉默機制躲避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，并且可以依靠miRNA對抗宿主細胞的免疫反應[5]。作為基因表達的調控因子，每個miRNA可以調節(jié)數(shù)百個靶基因，其在細胞增殖、分化、凋亡，及發(fā)育、器官形成等一系列生命過程中發(fā)揮著重要作用[6]。通過基因芯片篩選，在結核病患者中有771個基因發(fā)生差異表達，其中407個基因表達上調，364個基因表達下調，這771個基因受12個miRNA調控。一些miRNA在有毒力和無毒力的結核分枝桿菌中也會發(fā)生不同的調控作用。如miRNA可以調控凋亡調節(jié)蛋白BCL2基因的編碼，在結核分枝桿菌無毒菌株侵染的情況下，刺激巨噬細胞凋亡，可避免細菌逃離免疫系統(tǒng)識別。與此相反，在有毒力結核分枝桿菌侵染情況下，引起巨噬細胞進行程序性細胞死亡，細菌可以從細胞膜中滲透出去，躲避免疫系統(tǒng)識別，進行傳播[7]?？傊琺iRNA可能在基因表達調控領域起著超乎預料的作用。

在結核病的發(fā)生發(fā)展機制中，miRNA不僅可以通過標記到基因上進行靶向調控，也可以通過高甲基化抑制免疫系統(tǒng)調控。miRNA表達也會受到甲基化的調控。DNA甲基化是一種酶介導的化學修飾，是指在DNA甲基轉移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉變?yōu)?-甲基胞嘧啶的反應。miRNA高甲基化與一些抑制免疫系統(tǒng)調控的基因甲基化密切相關，當利用甲基化抑制劑降低某些miRNA甲基化水平時，可以達到使該miRNA靶基因表達上調的目的。如在一些肺部疾病中 miR-9-1、miR-124a3、miR-148、miR-152和miR-663均發(fā)生了不同程度（34%～86%）的甲基化異常[8]。

2 miRNA在肺結核病診斷中的應用

2.1 miRNA在潛伏性肺結核病診斷中的應用

潛伏性肺結核（latent tuberculosis infection，LTBI）通常是指肺內存在結核桿菌，皮膚結核菌素試驗呈陽性，但未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和影像學改變。全球結核菌感染者中，超過90%表現(xiàn)為潛伏性結核感染，有85%～90%新診斷的活動性肺結核由LTBI演變而來[9]。因此，LTBI的早期診斷日益受到重視，對我國結核病的預防和控制具有重要意義。

Wang等[10]比較了潛伏性和活動性肺結核患者的miRNA表達情況，發(fā)現(xiàn)與活動性肺結核患者相比，LTBI患者血清中的 miR-130b*、miR-342-5p、miR-155、miR-181b、miR-548b-3p表達降低。miR-155直接受Foxp3調節(jié)，F(xiàn)oxp3通過靶向抑制作用抑制細胞因子信號1（SOCS1），是保證T細胞中IL-2含量的關鍵因素[11]。當機體受結核分枝桿菌侵染時，體內的免疫球蛋白類物質受損，從而導致胞嘧啶核苷脫氨酶被活化誘導，推動Th2細胞在T細胞中發(fā)揮功能，導致miR-155的表達降低[12]。miR-181被證明在B細胞分化過程中起正調節(jié)作用，當體內有結核分枝桿菌侵入時miR-181表達異位，導致CD19、B細胞和T細胞伴隨減少[13]。

潛伏性結核病感染患者中Toll樣受體10（Tolllike receptors-10，TLR10）顯著上調，這與miR-146a有關。當受脂多糖刺激后，miR-146a和miR-146b轉錄上調，但只有成熟的miR-146a表達上調，miR-146a可以靶向TLR信號通路，影響其表達[14-15]。這些都說明，通過對miRNA水平分析，有可能達到早期診斷潛伏性肺結核病并加以控制的目的。

2.2 miRNA在活動性肺結核病診斷中的應用

Fu等[16]用miRNA芯片技術檢測了活動性結核患者血循環(huán)中的miRNA，在所檢測的1223個miRNA中，有95個在痰液中差異表達；有92個在血清中差異表達，其中59個為高表達、33個為低表達。結核患者血清與正常血清相比miR-3125低表達，而miR-93*和miR-29a高表達，表明miR-29a有可能是活動性結核病診斷的重要指標。一些研究結果顯示，miR-155和miR-155*也是迄今診斷結核病效果較好的潛在指標[17]。與潛伏性肺結核相比，活動性肺結核患者血清中顯著表達的miRNA有miR-144、miR-424、miR-451、miR-21*、miR-486-5p等12個，其中miR-144的表達增高尤為明顯[18]。這些表明了miRNA在活動性肺結核感染中存在功能，為今后結核病的診斷與防治提供了新方法和新思路。

最新的一項研究表明，miR-99b在結核分枝桿菌H37Rv株感染的樹突狀細胞和巨噬細胞中表達水平上調。但隨著結核分枝桿菌在樹突狀細胞中數(shù)量的增長，miR-99b的表達會被抑制，與此同時細胞因子IL-6、IL-12等的含量會增加[19]。在結核桿菌感染的巨噬細胞中miR-29A的表達上升，主要干擾素-C對巨噬細胞內感染的細菌進行抑制免疫反應，使miR-29A的表達量上升[20]。而Ma[21]等通過實驗篩選到了結核分枝桿菌感染后在Ⅱ型干擾素分泌型免疫細胞中顯著下調的miR-29。通過體外實驗證實了miR-29家族成員均可以直接靶向γ型干擾素的3'非翻譯區(qū)，從而抑制其表達。

miRNA在活動性肺結核病患者的痰液中能夠穩(wěn)定存在[22-23]，在許多肺部疾病，如肺癌和慢性阻塞性肺部疾病患者的痰液中會產(chǎn)生特有的miRNA[24]。有些miRNA在活動性結核病患者的痰液和血清中沒有顯著差異表達，如miR-150和miR-155[25]。血清與痰液中的差異表達miRNA也存在不一致性，例如，與對照組比較，miR-19B-2*和miR-3179在活動性結核病患者的痰液中表達量很高，而miR-518D-5p和miR-93在活動性結核病患者的血清中表達量很高。

3 結語

眾多miRNA參與肺部疾病發(fā)展進程，在基因的表達調控中起關鍵作用，受到越來越多的重視。通過對血清和痰液樣品中的miRNA進行檢測，可以實現(xiàn)診斷結核病的目的，有著重要的意義。作為新的標志物，隨著對miRNA研究的不斷深入，相信會有更多關鍵的miRNA被發(fā)現(xiàn)，也會有更準確、更方便的關于miRNA的檢測方法被研發(fā)，為結核病診斷與治療提供更多幫助，推動結核病診斷與治療的發(fā)展。

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