郝春緒，沈曉玲，譚文杰

1.內蒙古醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院微生物學教研室，內蒙古 呼和浩特 010110；2.中國疾病預防控制中心 病毒病預防控制所，北京 102206

冠狀病毒屬于套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬，在電子顯微鏡下呈日冕冠或皇冠狀，故得名[1]。目前冠狀病毒被分為4個屬，即α冠狀病毒屬（A系和B系）、β冠狀病毒屬（A～D系）、γ冠狀病毒屬和δ冠狀病毒屬[1]。冠狀病毒是有包膜的正鏈RNA病毒，基因組全長25～32 kb，是已知所有RNA病毒中基因組最大的[2]。病毒基因組的兩端分別包含一個非翻譯區(qū)（5'-UTR和3'-UTR），其中5'端約3/4包含2個大的重疊的開放讀框ORF1a和ORF1b，主要編碼與病毒復制轉錄有關的酶類等非結構蛋白，3'端約1/4的基因主要編碼表面棘突（spike，S）蛋白、膜（mem?brane，M）蛋白、小包膜（small envelope membrane，E）蛋白及核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白等主要結構蛋白[2]。

1 人冠狀病毒感染概述

冠狀病毒感染是一類動物源性疾病，宿主范圍廣泛，與人和動物的許多疾病有關[1-3]。2012年前發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒（human coronavirus，HCoV）包括HCoV-OC43、HCoV-229E、SARS-CoV、HCoV-NL63和HCoV-HKU1[3-5]，其中HCoV-NL63和HCoV-229E為α冠狀病毒，SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoVHKU1均為β冠狀病毒。2012年在中東地區(qū)新發(fā)現(xiàn)的中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）為第6種人冠狀病毒[6]。在6種人冠狀病毒中，HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1等4種在人群中普遍存在并呈全球性分布，通常引起急性呼吸道癥狀，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、流涕，嚴重者表現(xiàn)為喉炎、支氣管炎、毛細支氣管炎及肺炎等，也有導致胃腸道與神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的報道[1-3]。2003年起源于我國廣東的SARS-CoV曾在全球多個國家與地區(qū)暴發(fā)流行，主要引起成人急性呼吸道癥狀，嚴重者造成死亡[4-5]，但2005年迄今已無新的感染病例報道。而2012年新發(fā)現(xiàn)的MERS-CoV，感染者的主要癥狀表現(xiàn)為重癥急性呼吸道感染并伴發(fā)腎功能衰竭[6]，截至2014年1月10日，WHO報道全球實驗室確診177人感染，74人死亡，存在隱性感染病例與有限人際傳播能力[7]。

高致病性的SARS-CoV與MERS-CoV分離培養(yǎng)須在生物安全三級實驗室進行，而其他4種HCoV的分離培養(yǎng)技術難度較大，不適于常規(guī)實驗室診斷。目前人冠狀病毒感染的實驗室診斷主要有核酸檢測與血清學檢測[5，8-9]。RT-PCR與熒光定量RT-PCR等核酸檢測技術能在人冠狀病毒感染的早期進行快速診斷，是目前應用最為廣泛的技術，但它在很大程度上依賴于有經(jīng)驗的技術人員和專業(yè)實驗室設備，易污染；而血清學檢測方法不僅可用于感染診斷，并可監(jiān)測感染者體內特異性抗體的變化情況及既往感染規(guī)律、人群易感狀況等流行病學數(shù)據(jù)，可為疾病的防治與疫苗研發(fā)提供參考依據(jù)[8-10]。

2 人冠狀病毒感染的血清學檢測技術

人冠狀病毒感染的血清學檢測技術目前主要包括[8-20]：針對冠狀病毒的主要結構蛋白（N和S蛋白）等，采用間接免疫熒光（IFA）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、蛋白印跡等技術檢測特異性結合抗體（IgG與IgM）；檢測血清中和抗體的基于真病毒或假型病毒的體外微量中和試驗[15-16]。此外，因N蛋白為冠狀病毒結構蛋白中含量最豐富和保守的蛋白質，常在感染早期病人血清中出現(xiàn)[12]，可制備N蛋白特異性單抗，建立雙抗體夾心EIA檢測血清中的N抗原。

2.1 抗體檢測

2.1.1 抗原的選擇與優(yōu)化 結構蛋白是冠狀病毒血清學抗體檢測的主要候選抗原[8-19]，其中報道最多的是N和S蛋白，而M和E蛋白的報道較少[8-15]。因人冠狀病毒全長N蛋白序列本身在各病毒間存在一定的保守性，作為抗原檢測血清抗體易導致交叉反應與假陽性，須進行抗原優(yōu)化。如原核表達的全長SARS-CoV N蛋白，作為抗原檢測人群中血清抗體，無論是采用EIA還是蛋白印跡法，均可發(fā)現(xiàn)與其他冠狀病毒（HCoV-229E與HCoV-OC43）存在交叉反應[20-22]。如將全長SARS-CoV N蛋白抗原分為3段，即N1（1～422 aa）、N2（1～109 aa）和N3（110～422 aa）進行表達純化，結果顯示采用N1、N3作為候選抗原可更好地提高血清學檢測的特異性[19]。若將N蛋白分成39個不同片段，從中選擇6個片段PN360（1～360 aa）、PN301（1～301 aa）、PN199（30～228 aa）、PN185（30～214 aa）、PN155b（60～214 aa）和 PN125（90～214 aa）進行抗原性研究，結果顯示在6種片段中，PN185和PN155b更適合作為候選抗原進行SARS特異性血清抗體的檢測[21]。

相對于N蛋白，截短型S蛋白作為抗原檢測血清抗體具有更高的特異性[22]。采用人冠狀病毒S蛋白作為抗原檢測血清抗體，很少有存在交叉反應的報道[10-11，14]。研究證明，冠狀病毒S蛋白的受體結合區(qū)（RBD）包含多個構象的抗原，可以誘發(fā)機體產(chǎn)生高滴度的中和抗體[15-16]。相對于全長S蛋白，截短型S蛋白或RBD更易于在大腸桿菌及各種真核系統(tǒng)（如昆蟲桿狀系統(tǒng)或293T細胞）中得到高效表達，獲得構象合理的純化蛋白，可作為特異敏感檢測感染后血清抗體的候選抗原[15-18]。應用S蛋白和N蛋白的融合片段作為抗原，可以提高血清學檢測的特異性[23]。2009年，Gimenez等以S蛋白的251～683 aa片段和N蛋白（除了25個C端氨基酸殘基序列）組成的4種人工合成多肽混合物為抗原進行了血清學篩查，敏感性和特異性均達90%以上，而混合的多肽作為候選抗原比單個肽更適合血清學的檢測[23]。

目前，關于各HCoV抗原的選擇與優(yōu)化仍是抗體檢測的關鍵技術問題。

2.1.2 常見的人冠狀病毒感染血清學抗體檢測技術 實驗室常用的人冠狀病毒血清學抗體檢測技術包括ELISA、IFA、蛋白芯片、蛋白印跡及中和實驗等，每種方法存在著各自的優(yōu)勢和不足[8-29]。ELISA目前已廣泛用于人冠狀病毒（尤其是SARS-CoV）感染的血清學診斷[8-9]，其優(yōu)點是經(jīng)濟、快速、簡便、敏感性強、特異性高[18-19，23]。相對于 ELISA，IFA 更易建立，因后者無須獲得純化的蛋白抗原，尤其是難于表達純化的糖蛋白結構抗原，可通過構建真核表達質粒轉染細胞而直接進行檢測[8，14，26-27]。蛋白印跡法應用于冠狀病毒的血清學抗體雖有不少報道[13，22]，但由于操作繁瑣，不易標準化，目前很少推廣應用。面對2012年新發(fā)現(xiàn)的MERS-CoV感染，最先建立的血清學抗體快速檢測手段即為間接免疫熒光法[27]，隨后建立了檢測特異性抗體的蛋白芯片法與高通量操作安全的基于假病毒的體外微量中和檢測法[28-29]。對于難培養(yǎng)或高致病性的人冠狀病毒感染，建立基于假病毒的體外中和抗體檢測方法，不僅可敏感、特異、高通量檢測中和抗體[15-16,29-30]，因其不需要在生物安全三級實驗室中完成，還非常適合大范圍的血清流行病學研究，同時可以使我們更好地理解MERSCoV的生態(tài)學和流行病學[29,31]。

2.2 抗原檢測

人冠狀病毒抗原檢測主要針對人冠狀病毒的結構蛋白，通過制備基于結構蛋白的單抗或多抗，采用特異的雙抗體夾心技術檢測血清中相應抗原的含量，目前報道多為檢測SARS-CoV的N抗原[32-41]。2004年國內學者車小燕篩選制備了多株SARSCoV N蛋白特異的單抗，并建立了通過檢測血清中N抗原早期診斷SARS-CoV感染的ELISA檢測試劑盒，在臨床得到廣泛應用[33-34]。Shin等運用昆蟲細胞表達的SARS-CoV N蛋白制備了17種單抗，篩選了3種針對N端的單抗和2種針對C端的單抗，發(fā)現(xiàn)它們與其他人冠狀病毒的N蛋白沒有交叉反應，證實這些單抗對SARS-CoV臨床診斷試劑盒的開發(fā)很有價值[32]?；瘜W發(fā)光檢測冠狀病毒抗原，可以快速、敏感地檢測到2 pg/mL濃度以下的目的蛋白。Fujimo?to等制備了與化學發(fā)光相結合的單抗，檢測SARS病人鼻咽抽取液中的N蛋白，發(fā)現(xiàn)它們與普通冠狀病毒（229E、NL63、OC43）的重組N蛋白沒有交叉反應，與感染229E、NL63、OC43的溶解產(chǎn)物均沒有交叉反應。作者同時檢測了18份陽性標本和20份陰性標本，發(fā)現(xiàn)其敏感性和特異性均達到100%，遠高于以前的ELISA和RT-PCR檢測技術[35]。近期Kammila等建立了一種針對SARS-CoV N蛋白的雙功能單抗和雞多抗的Immunoswab方法，可在40～60 min發(fā)現(xiàn)病人體液中的N蛋白，是一種非常實用的方法[36]。Palaniyappan等將在大腸桿菌中表達的SARS-CoV全長N蛋白制備出鼠單抗和雞多抗，結果顯示2種針對N蛋白的抗體都很敏感，最重要的是使用雞多抗不僅在檢測抗原方面非常敏感，而且價格很便宜，是一種具有開發(fā)前景的診斷試劑[37]。最近也有學者報道了通過建立雙抗體夾心ELISA檢測抗原的方法，可鑒別診斷2種常見Ⅰ型人冠狀病毒（HCoVNL63與HCoV-229E）感染[38]。

除了雙抗體夾心ELISA方法外，近年來許多新的分子（核酸適配體）或電化學標記技術也應用于SARS-CoV N抗原的檢測，并呈現(xiàn)出超高靈敏度與自動化檢測應用前景[39-41]。此外，通過制備篩選S蛋白特異性單抗，也可建立靈敏特異地檢測SARSCoV S抗原的雙抗體夾心ELISA方法[42]。

3 結語

綜合上述進展可以看出，自2003年SARS暴發(fā)至今，通過各國科學家的積極努力，人冠狀病毒在血清學方面的研究在近幾年已獲得了眾多進展，尤其是目前SARS-CoV感染的血清學檢測技術比較成熟，已建立試劑評價的血清盤[43]，相關診斷試劑盒已批準上市并已得到廣泛應用。但其他人冠狀病毒（如新發(fā)的MERS-CoV）感染的血清學檢測技術仍在發(fā)展與應用評價中，主要的瓶頸是缺乏合適的血清標準品，有很多血清學應答特點（抗原的選擇與優(yōu)化，血清抗體交叉反應等）還需要深入研究。為有效防控近期新發(fā)的MERS-CoV的感染傳播，盡快建立檢測MERS-CoV感染的抗體、抗原等血清學檢測方法，并對MERS-CoV的中和抗體進行深入研究，已成為目前人冠狀病毒研究領域的當務之急。

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