呂慧威，胡雪蓮，蔡 勇

（1.吉林師范大學博達學院，吉林 四平 136000；2.四平金士百純生啤酒有限公司，吉林 四平 136001）

隨著消費水平的提高，消費者的滿足度已經(jīng)不僅停留在啤酒帶來的口感和視覺享受，啤酒的生產(chǎn)安全性、產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性越來越得到關(guān)注。啤酒的貨架期是由其生物穩(wěn)定性、非生物穩(wěn)定性和風味穩(wěn)定性決定的[1]，隨著研究的深入，前兩項已不再是引起啤酒質(zhì)量問題的主要原因，科研工作者已把研究重點轉(zhuǎn)移到啤酒風味和口感變化的主要影響因素，人們也正在積極探索導致啤酒風味老化的主要原因及防范措施。啤酒老化可以延緩，但不可以杜絕，重點是通過調(diào)控生產(chǎn)出風味穩(wěn)定性高的啤酒，從而延長啤酒保鮮[2]。為了提高啤酒的抗老化性能，一方面盡可能多地保留一些還原性物質(zhì)到啤酒中去；另一方面要盡可能少的產(chǎn)生老化風味的前驅(qū)物質(zhì)[3]。

糖化是制造啤酒的重要環(huán)節(jié)之一，為了提高原料利用率并保證啤酒質(zhì)量，糖化過程需要較長時間地借助于熱的作用，在較高溫度條件下麥汁中的成分會發(fā)生氧化等反應(yīng)[4]，因此糖化過程不僅是麥汁產(chǎn)生的過程，也是啤酒風味老化物質(zhì)及其前軀體大量生成的階段[5]，高的熱負荷意味著啤酒老化的前驅(qū)體物質(zhì)數(shù)量增多，會給麥汁和啤酒帶來焦糊口味，不利于啤酒的口味穩(wěn)定性[6]，減少熱負荷，有利于降低麥汁的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值及老化物的生成[7]。麥汁各階段熱負荷的增加值主要由溫度和在該溫度條件下的停留時間所決定[8]。由于回旋槽中溫度相對較高，而揮發(fā)性弱，分析可能會造成醛的積累，因而麥汁在回旋槽的停留時間對老化羰基化合物的影響值得深入思考[2]。前期有關(guān)學者已就煮沸階段熱負荷對啤酒老化的影響進行了深入研究，但回旋沉淀階段的影響鮮為報道，值得深入研究。反-2壬烯醛（trans-2-nonenal，T2N）的前驅(qū)物就是在糖化過程中產(chǎn)生的，它是由麥芽中的脂肪酸在酶的作用下形成的，也被視為是原料新鮮度的指示劑[9]，要降低成品啤酒中的T2N，最重要的是減少糖化過程中T2N及其前驅(qū)物的產(chǎn)生[10]。本研究以TBA值、T2N及其前驅(qū)物等為指標，評價了回旋沉淀階段熱負荷對麥汁老化的影響，并對固相微萃取氣質(zhì)法聯(lián)用（solid phase extraction-chromatograph-mass spectrometry，SPME-GC/MS）法檢測麥汁中反-2壬烯醛（T2N）前驅(qū)體的方法進行了優(yōu)化，以期為啤酒生產(chǎn)中糖化階段熱負荷的控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗麥汁、發(fā)酵液及啤酒：四平金士百純生啤酒有限公司。

反-2-壬烯醛標準品（色譜純）：美國Sigma公司；無水乙醇（色譜純）、磷酸（分析純）、NaCl（分析純）：天津市濱?？频匣瘜W試劑有限公司；高純二氧化碳（純度≥99.5%）：企業(yè)自產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

配有75 μm CAR-PDMS萃取頭的SPME裝置：德國SIGMA-aldrich公司；Clarus600 GC/MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電子電離源）：美國PE公司；UGC-12MF氮吹儀：北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；FE20型pH計：瑞士Mettler Toledo集團公司；UV1800型分光光度計：日本島津公司、Vos Rot 90/25型自動濁度儀：荷蘭HAFFMANS公司。

1.3 方法

1.3.1 T2N前驅(qū)體檢測的樣品前處理方法[11-12]

將氮吹儀通入高純二氧化碳，用移液管準確移取5 mL待測樣品于22 mL頂空瓶中，加入3 g NaCl，并用二氧化碳吹走瓶中的空氣，2 min后迅速壓蓋密封，沸水浴中煮沸120 min，再置于50 ℃恒溫水浴中用75 μm CAR/PDMS萃取頭萃取90 min，待檢測。

1.3.2 儀器分析條件

（1）色譜條件

色譜柱：HP-5MS毛細管色譜柱（40 m×0.32 mm×0.25 μm）；載氣：氦氣（純度≥99.999%）；流速：1 mL/min；升溫程序：柱溫箱起始溫度60 ℃，以3 ℃/min升至100 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃，保持7 min，以10 ℃/min升至290 ℃，保持5 min；進樣口溫度：280 ℃；分流方式：不分流；進樣量：1 μL。

（2）質(zhì)譜條件

電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源，電離電壓70 eV，離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃，測定模式為選擇離子監(jiān)測（selected ion monitoring，SIR），溶劑延遲3 min，全掃描質(zhì)核比范圍29～300 u。

1.3.3 檢測方法

（1）麥汁透光率的檢測方法

用離心試管量取50 mL麥汁，充分混合均勻后在波長530 nm條件下檢測其吸光度值。

（2）麥汁濁度的檢測方法

（3）T2N前驅(qū)體的檢測方法

采用SPME-GC/MS方法測定樣品中的T2N前軀體含量。用保留時間和離子碎片比例定性，用外標法定量，用峰面積計算。標準工作液和待測樣液中的T2N前軀體含量值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度與響應(yīng)值有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R為0.991～0.998 范圍內(nèi)。

（4）麥汁TBA值的檢測方法[13-14]

參照參考文獻[13-14]中的分光光度計法，測定麥汁TBA值。

（5）麥汁中9種典型老化物質(zhì)的檢測方法[15]

參照參考文獻[15]中的氣相色譜質(zhì)譜法（GC/MS），測定麥汁中9種典型老化物質(zhì)（糠醛、2-乙?；秽?、苯甲醛、5-甲基糠醛、苯乙醛、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、煙酸乙酯、γ-壬內(nèi)酯）。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥汁T2N前軀體檢測方法的優(yōu)化

2.1.1 T2N前軀體的定性定量分析

任何事物與其他事物之間的矛盾，是事物發(fā)展的外部原因。傳統(tǒng)體育各有不同的形式存在，但又有共通相似之處；正因為這些異同，造成了神圣形式上的博弈：

定性分析：用乙醇作溶劑，配制100 μg/mL T2N標準樣品，直接自動進樣分析，初步確定該物質(zhì)的保留時間為15.98 min，查看離子碎片發(fā)現(xiàn)各碎片符合該物質(zhì)在譜庫里的比例。

選擇定量碎片：從NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中搜索T2N的特征離子碎片，含量較高的有41、70、122和140，含量最高的是41，但因為這個碎片質(zhì)量數(shù)太低，而且大部分化合物都會有，不具有典型性，掃描后會有大量其他碎片干擾，出現(xiàn)的峰不是目標峰，影響對結(jié)果的判斷。而其他三個碎片質(zhì)量數(shù)相對較高，掃描后匹配度較高。圖1為提取41、70、122和140離子碎片的色譜圖，峰值高度代表其響應(yīng)值強度。由圖1可知，70碎片響應(yīng)值最高。最終確定選擇70、122和140為標樣的定性離子碎片，選擇70為定量離子碎片。

圖1 不同選擇離子碎片下的T2N色譜圖Fig.1 T2N chromatogram of different fragments under the selected ion

驗證目標峰：取10 mL麥汁處理后進樣分析，可以檢測到目標峰。為進一步驗證，在麥汁中加入一定量標樣，按照麥汁處理的方法萃取后再次檢測，發(fā)現(xiàn)原有的目標峰峰面積有所增加，說明15.98 min出現(xiàn)的峰就是所要檢測的目標峰。

2.1.2 標準曲線的繪制

麥汁經(jīng)高溫煮沸后的反-2-壬烯醛（T2N）含量可達200 μg/L，依據(jù)此數(shù)據(jù)設(shè)計了在麥汁中添加標準品0、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L和400 μg/L，按照樣品的前處理過程操作并用氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC/MS）檢測其峰面積，結(jié)果扣除空白，分別以各自的峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）進行回歸計算，得到回歸方程見表1。

表1 兩根萃取頭T2N的標準工作曲線Table 1 The T2N standard working curve of two extraction fibers

從表1可以看出，兩根萃取頭的檢測結(jié)果均具有良好的線性關(guān)系，R2均＞0.990，認為可以用作結(jié)果的定量分析。

2.1.3 方法重復(fù)性和再現(xiàn)性的驗證

表2 兩根萃取頭T2N的重復(fù)性和再現(xiàn)性結(jié)果Table 2 The T2N repeatability and reproducibility of two extraction fibers

經(jīng)過之前一系列方法優(yōu)化后，檢測結(jié)果較穩(wěn)定。如表2所示，從第2天的連續(xù)5針結(jié)果可以看出，A萃取頭的單天重復(fù)性相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為2.67%，連續(xù)3 d的再現(xiàn)性為2.22%，遠遠低于重復(fù)性＜10%，再現(xiàn)性＜15%的要求；B萃取頭較A萃取頭的結(jié)果稍高一些，但也符合要求，說明該方法的結(jié)果重現(xiàn)性和再現(xiàn)性符合檢測要求。

2.1.4 加標回收率的測定

表3 兩根萃取頭T2N的加標回收率結(jié)果Table 3 Adding standard recovery rate of two extraction fibers

在麥汁中分別加入40 μg/L和80 μg/L標樣，按照樣品的前處理方法煮沸、萃取、分析，扣除空白后計算含量，結(jié)果見表3。由表3可知，兩個萃取頭的兩個不同質(zhì)量濃度加標的回收率都在90%～105%，滿足回收率80%～120%的檢測要求。

結(jié)果表明，經(jīng)優(yōu)化的T2N檢測方法可以作為麥汁老化物質(zhì)反-2-壬烯醛含量的一種可靠的評價手段。

2.2 回旋沉淀時間對麥汁老化程度的影響

為了驗證回旋沉淀時間對麥汁老化物質(zhì)的影響，設(shè)計試驗將回旋沉淀時間由原來的30 min縮短為25 min和20 min，以T2N和TBA值為指標評價其差異。試驗之前先要以透光率和濁度為指標對麥汁的澄清效果進行評價。

2.2.1 麥汁不同冷卻時間透光率和濁度的差異

為驗證回旋沉淀時間對麥汁老化程度的影響，需要取樣進行T2N和TBA的檢測，但選取哪個冷卻時間的樣品更具有代表性尚不明顯，一鍋麥汁冷卻過程從開始至完畢大約需要60 min左右的時間，在這區(qū)間選擇哪個時間取樣最合適，是不是每批樣品都有這個趨勢尚不明確，因此，本輪試驗分別取冷卻開始、冷卻30 min和冷卻60 min三個時間段的麥汁，檢測透光率和濁度，比較其差異。

圖2 麥汁不同冷卻時間對透光率和濁度平均值的影響Fig.2 Effect of different cooling time on average value of wort transmittance and turbidity

分別選取三個不同品種、不同生產(chǎn)時間的麥汁樣品進行檢測，比較其差異。從圖2可以看出，隨著冷卻時間的延長，麥汁的濁度平均值逐漸降低，透光率的平均值逐漸升高，說明冷卻后期麥汁的澄清效果最好，而且三個品種麥汁的變化趨勢完全一致。從圖3可以看出，隨著冷卻時間的延長，麥汁的濁度和透光率多次檢測結(jié)果的RSD都呈逐漸減小的趨勢，由于品種不同，減小的幅度有所差異，但趨勢是一致的，說明到冷卻的后期不但澄清度高了，而且系統(tǒng)更穩(wěn)定，檢測的結(jié)果更穩(wěn)定。因此，選擇在冷卻60 min時取麥汁樣品進行分析更具有代表性。

圖3 麥汁不同冷卻時間對透光率和濁度RSD的影響Fig.3 Effect of different cooling time on RSD of wort transmittance and turbidity

2.2.2 麥汁不同回旋沉淀時間透光率和濁度的差異

本試驗選取了進入同一個發(fā)酵罐的4鍋麥汁中的后3鍋作為試驗對象，保證除了試驗因素的不同外，其他條件，包括原輔料、添加劑、生產(chǎn)設(shè)備都是同一批。

表4 不同回旋沉淀時間對麥汁透光率和濁度的影響Table 4 Effect of different whirlpool time on wort transmittance and turbidity

3批平行試驗的透光率和濁度見表4。比較9批麥汁的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著回旋沉淀時間的縮短，透光率都有所降低，而濁度呈上升趨勢，只是變化的幅度有所不同。其中，將回旋沉淀時間由原來的30 min縮短至25 min時，透光率和濁度有輕微變化，透光率增加了2.64%，濁度增加了2.13%，變化幅度非常??；而將回旋沉淀時間縮短至20 min時，二者都有較明顯變化，其中，透光率較30 min增加了16.74%，濁度增加了15.65%。結(jié)果表明，將回旋沉淀時間縮短5 min對麥汁的濁度影響不大，但縮短10 min將會明顯影響麥汁的澄清效果，這樣將會對后期的過濾等環(huán)節(jié)產(chǎn)生很大影響。

2.2.3 麥汁不同回旋沉淀時間T2N和TBA的差異

表5 不同回旋沉淀時間T2N和TBA比較Table 5 The T2N and TBA in different whirlpool time

3批平行試驗的T2N和TBA見表5。比較9批麥汁的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將回旋沉淀時間由30 min縮短至25 min時，T2N的含量降低了12.39%，較之前明顯降低，TBA也由0.334降至0.314，降低了5.99%；而從25 min縮短至20 min時，二者的含量也在呈下降趨勢，但幅度沒有那么明顯，T2N和TBA分別降低了1.00%和2.87%。從上述結(jié)果可以看出，當回旋沉淀時間過長，尤其是＞25 min時，大大增加了反應(yīng)體系的熱負荷，導致多種老化物質(zhì)，尤其是醛類物質(zhì)的生成。因此，適當降低沉淀靜止時間，可有效降低老化物質(zhì)及其前軀體的含量，但時間過短，沉淀效果不好又對麥汁的清亮度產(chǎn)生較大影響。因此，將回旋沉淀時間縮短至25 min既可減少老化物質(zhì)的生成，還能保證麥汁的澄清質(zhì)量。

2.2.4 麥汁不同回旋沉淀時間9種典型老化物質(zhì)的差異

圖4 麥汁不同回旋沉淀時間9種典型老化物質(zhì)含量比較Fig.4 The content of 9 kinds of typical aging substance in wort with different whirlpool time

由圖4可知，在檢測的9種典型老化物質(zhì)中，隨著回旋沉淀時間的縮短，糠醛的含量有明顯的降低，而其他8種物質(zhì)沒有明顯的變化，說明糠醛受熱負荷影響最大，在溫度一定的條件下，時間越短，熱負荷越小，分析其原因為，糠醛是美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，該反應(yīng)受熱負荷影響較大，這也是糠醛常常被作為熱負荷指示劑的原因，因此，將回旋沉淀時間縮短至25 min，是在保證麥汁澄清質(zhì)量的基礎(chǔ)上，大大降低老化物質(zhì)含量較有效的方法。

3 結(jié)論

隨著回旋沉淀時間的縮短，透光率都有所降低，而濁度呈上升趨勢，將回旋沉淀時間縮短5 min對麥汁的濁度影響不大，但縮短10 min將會明顯影響麥汁的澄清效果。

將回旋沉淀時間由30 min縮短至25 min和25 min縮短至20 min時，T2N、TBA和糠醛的含量都有所降低，但縮短5 min的幅度＞10 min，因此，適當降低沉淀靜止時間，可有效降低老化物質(zhì)及其前軀體的含量。

結(jié)果表明，將回旋沉淀時間縮短至25 min，在保證麥汁澄清質(zhì)量的基礎(chǔ)上可明顯降低老化物質(zhì)含量，大大提高啤酒的抗老化能力。降低回旋沉淀時間可有效降低麥汁熱負荷，減少老化物質(zhì)及其前驅(qū)體的生成，降低了潛在隱患，是提高啤酒抗老化能力的有效途徑之一。

[1]趙 雅.制麥與釀造工藝對麥芽及啤酒抗氧化性的影響[D].揚州：揚州大學碩士論文，2012.

[2]郝俊光，尹 花，李 華.啤酒老化綜合評價手段的建立及應(yīng)用研究[J].啤酒科技，2012（6）：24-30.

[3]宋玉梅.糖化工藝對啤酒老化的影響[J].啤酒科技，2001（7）：42-43.

[4]李 紅，方貴權(quán)，李惠萍，等.麥汁在糖化熱負荷作用下的老化動力學及對啤酒風味穩(wěn)定性的影響[J].啤酒科技，2013（3）：28-33.

[5]邵 鎧，李 紅，張五九.啤酒大生產(chǎn)中抗氧化能力影響因素的研究[J].中國釀造，2012，31（4）：154-157.

[6]常宗明，喬萬昌，董建軍，等.啤酒釀造過程熱負荷變化的研究[J].啤酒科技，2010（7）：32-34.

[7]張 肅.糖化工段對啤酒老化味的影響及控制措施[J].啤酒科技，2009（10）：59-62.

[8]陳 華，勞杰明.糖化熱負荷監(jiān)控體系的研究與建立[J].啤酒科技，2012（2）：34-35.

[9]郝俊光，梁 剛，陳華磊，等.糖化熱負荷與啤酒老化關(guān)系的研究檢測啤酒中的醛酯類老化物質(zhì)[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（10）：153-158.

[10]李 霞，高 燕.啤酒中老化味物質(zhì)T2N 檢測方法的研究[J].啤酒科技，2011（6）：35-38.

[11]SCHERER R,WAGNER R,KOWALSKI C H,et al.(E)-2-Nonenal determination in brazilian beers using headspace solid-phase microextraction and gas chromatographic coupled mass spectrometry (HS-SPMEGC-MS)[J].Food Sci Technol,2010,30(5):161-165.

[12]李勇強，唐朝艷.用頂空固相微萃取和帶質(zhì)譜儀的氣相色譜檢測巴西啤酒中的反-2-壬烯醛[J].啤酒科技，2010（12）：63-65.

[13]管敦儀.啤酒工業(yè)手冊（上冊）[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1998.

[14]李 鳳，周廣田.用TBA 法測啤酒糖化過程對老化的影響[J].中國釀造，2008，27（3）：61-62.

[15]江 偉，李 紅，周 梅，等.采用GC-MS 同時檢測啤酒中的醛酯類老化物質(zhì)[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（10）：153-158.