葉菡洋 陳琰 金建 李占園 金領(lǐng)微 鄭育 王紅 周志宏

microRNA-101a在尿酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用

葉菡洋 陳琰 金建 李占園 金領(lǐng)微 鄭育 王紅 周志宏

目的 研究尿酸對腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響及microRNA-101a在其中的作用。方法 體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E），分別以0、10、100、500μmol/L的尿酸誘導(dǎo)細(xì)胞，采用實時定量PCR檢測各組α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、I型膠原（ColⅠ）及E鈣蛋白mRNA的表達(dá)水平；Wersten blot檢測各組中α-SMA的表達(dá)，免疫熒光檢測各組中膠原蛋白I（COL）表達(dá)水平，觀察細(xì)胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)分化。再用實時定量PCR檢測各組中miR-101a及COX-2mRNA的表達(dá)水平，Wersten blot檢測各組中COX-2的表達(dá)。進(jìn)一步實驗選擇100μmol/L尿酸誘導(dǎo)細(xì)胞，并轉(zhuǎn)染miR-101a mimics，分為3組，miR-101a組：先轉(zhuǎn)染miR-101a mimics，再以100μmol/L尿酸培養(yǎng)基培養(yǎng)；空白對照組：以100μmol/L尿酸培養(yǎng)基培養(yǎng)；陰性對照組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染隨機合成的miRNA NC片段，再以100μmol/L尿酸培養(yǎng)基培養(yǎng)。檢測各組中α-SMA、ColⅠ、E鈣蛋白及COX-2mRNA的表達(dá)量。結(jié)果 培養(yǎng)基中尿酸濃度越高，α-SMA、ColⅠ表達(dá)水平也越高，E鈣蛋白越低，提示細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，同時miR-101a表達(dá)減少，COX-2mRNA表達(dá)增多。miR-101a組與空白對照組和陰性對照組比較，α-SMA、ColⅠ及COX-2的表達(dá)明顯降低（P＜0．05），E鈣蛋白明顯升高（P＜0．05），空白對照組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。結(jié)論 尿酸誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化可能呈濃度依賴性，miR-101a及COX-2可能參與尿酸誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的調(diào)節(jié)過程。

尿酸 microRNA-101a 環(huán)氧化酶-2 腎小管上皮細(xì)胞 上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化

在我國，尿酸性腎病是導(dǎo)致慢性腎功能不全的常見原因之一，許多臨床和實驗數(shù)據(jù)表明尿酸是慢性腎功能不全發(fā)展過程中的一個重要原因。目前這方面的研究多數(shù)是定位于尿酸導(dǎo)致腎臟內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致腎臟纖維化，腎小球濾過率下降[1-3]，但關(guān)于尿酸對腎小管上皮細(xì)胞影響的研究較少，其機制也尚未明確。環(huán)氧化酶-2（cycloxygenase-2，COX-2）是被公認(rèn)的介導(dǎo)炎癥的重要蛋白之一，有研究報道，microRNA-101a（miR-101a）具有調(diào)節(jié)COX-2表達(dá)的作用，參與許多炎癥反應(yīng)的過程[4]，而炎癥反應(yīng)是促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的重要因素之一。筆者通過尿酸誘導(dǎo)大鼠上皮細(xì)胞實驗，探討尿酸是否具有促進(jìn)對腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用及可能存在的機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 NRK-52E大鼠腎小管上皮細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫；胎牛血清（FBS）、培養(yǎng)基DMEM(low glucose)、Hanks平衡鹽溶液、0.05%胰酶/EDTA均購自美國Gibco公司；尿酸購自德國Sigma公司；Trizol、DEPC水（RNase-free and Dnase-free）、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司；流式細(xì)胞儀（flow cytometry，F(xiàn)CM）購自德國BD公司。miScript Reverse Transcription Kit購自德國Qiagen公司，PCR試劑盒（SYBR Green Realtime PCR Master Mix），96孔板及封板膜均購自美國ABI公司，RT試劑盒購自加拿大MBI Fermentas公司，電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自德國BIO-RAD公司，GAPDH、COX-2和α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的引物均購自美國Invitrogen公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Pierce公司，COX-2、I型膠原（collagen I，ColⅠ）和α-SMA抗體購自香港Abcam公司；酶標(biāo)儀ECX800購自美國Bio-TEX；Backman DU800計算機分光光度分析儀購自美國Backman公司；激光掃描共焦顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純化。

1.2 NRK-52E細(xì)胞的培養(yǎng)及尿酸誘導(dǎo) 以含有5% FBS的DMEM（低糖）培養(yǎng)基培養(yǎng)NRK-52E大鼠腎小管上皮細(xì)胞株，并于37℃、5%CO2的孵箱中孵育，平均每3d傳代培養(yǎng)。將同一代的細(xì)胞經(jīng)傳代后分4組，分別以0、10、100、500μmol/L尿酸培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。

1.3 實時定量PCR檢測

1.3.1 不同尿酸濃度誘導(dǎo)下的細(xì)胞α-SMA、ColⅠ和E鈣蛋白mRNA的表達(dá) 加尿酸培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，加Trizol裂解，氯仿萃取，異丙醇濃縮過夜，提總RNA，取300ng總RNA，應(yīng)用RevertAidTMFirst StrandcDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)試劑盒合成cDNA，再應(yīng)用ABI 7500 FAST型熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測α-SMA、ColⅠ、E鈣蛋白mRNA的表達(dá)。PCR條件：95℃退火15s，60℃延伸60s，共40個循環(huán)。采用GAPDH作為內(nèi)標(biāo)計算，樣品目的基因的相對表達(dá)率（relativeexpression，RQ）采用ΔΔCT方法計算[5]。引物序列詳見表1。

表1 GAPDH、α-SMA、ColⅠ與E鈣蛋白引物序列

1.3.2 不同尿酸濃度誘導(dǎo)下的細(xì)胞miR-101a和COX-2 mRNA的表達(dá) 加尿酸培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，加Trizol裂解，氯仿萃取，異丙醇濃縮過夜，提總RNA，取100ng總RNA，應(yīng)用miRNA Isolation Kit試劑盒分離＜100nt的小分子RNA，應(yīng)用miScript Reverse Transcription Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄引物：5＇-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTTCAGTT-3＇。再應(yīng)用ABI 7500 FAST型熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測miR-101a的表達(dá)。實時定量PCR條件：95℃退火5s，60℃延伸34s，共40個循環(huán)。上游引物：5＇-TTCGTCGTCGTCGGTACAGTACTGTGAT-3＇，下游引物：5＇-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3＇。采用U6 RNA作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計算。U6上游引物：5＇-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3＇，下游引物：5＇-CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3＇。COX-2 mRNA表達(dá)的檢測方法同上，COX-2上游引物：5＇-TGATCGAAGACTACGTGCAACAC-3＇，下游引物：5＇-CAGCAATCTGTCTGGTGAATGAC-3＇。

1.4 Western blot檢測

1.4.1 不同尿酸濃度誘導(dǎo)下的細(xì)胞α-SMA的表達(dá) 加尿酸培養(yǎng)48h后，裂解RNK-52E細(xì)胞提取總蛋白質(zhì)，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，取30μg總蛋白，行10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉。一抗（α-SMA抗體，1∶500）4℃孵育過夜，TBS-T溶液洗膜，室溫下加入IgG抗體（1∶4 000）孵育，洗膜，用Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)選擇800通道進(jìn)行掃描蛋白電泳條帶，以GAPDH作為內(nèi)參照標(biāo)化α-SMA的表達(dá)，用AlphaEaseFC凝膠成像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

1.4.2 不同尿酸濃度誘導(dǎo)下的細(xì)胞COX-2的表達(dá) 步驟同上，一抗為COX-2抗體1∶800，二抗為山羊抗兔抗體1∶4 000。

1.5 免疫熒光檢測不同尿酸濃度下ColⅠ的表達(dá) 尿酸誘導(dǎo)72h后，細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100破膜10min，5%的血清封閉室溫下45min，一抗（ColⅠ抗體 1∶100）4℃孵育過夜，PBS漂洗，二抗（Dy-Light 549標(biāo)記的驢抗兔，1∶500）37℃孵育1h，漂洗，再用4＇，6-二脒基-2-苯基吲哚染核，最后激光掃描共焦顯微鏡下觀察。

1.6 miR-101a mimics片段的合成、轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞 miR-101a mimics片段由上海吉瑪公司設(shè)計并合成。miR-101a mimics序列為：正義鏈：5＇-UACAGUACUGUGUAUAACUGAA-3＇，反義鏈：5＇-CAGUUAUACACACAGUACUGUAUU-3＇。miR-101a mimics陰性對照為隨機合成，正義鏈∶5＇-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3＇，反義鏈：5＇-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3＇，與大鼠基因組各基因均無顯著同源性。將NRK-52E細(xì)胞接種至6孔板，以每孔5μl的miR-101a mimics和5μl的Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分為3組，miR-101a組：先轉(zhuǎn)染miR-101a mimics，再以100μmol/L尿酸培養(yǎng)基培養(yǎng)；空白對照組：以100μmol/L尿酸培養(yǎng)基培養(yǎng)；陰性對照組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染隨機合成的miRNA NC片段，再以100μmol/L尿酸培養(yǎng)基培養(yǎng)。24h后棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS漂洗細(xì)胞，再收集細(xì)胞進(jìn)行實時定量PCR測定miR-101a表達(dá)量以檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.7 實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組中E鈣蛋白、ColⅠ、α-SMA和COX-2 mRNA的表達(dá) 實驗方法與計算方法同上。

1.8 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后各組中COX-2和α-SMA的表達(dá) 實驗方法與計算方法同上。

1.9 免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染后各組中ColⅠ的表達(dá) 實驗方法與計算方法同上。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1 實時定量PCR檢測不同尿酸濃度誘導(dǎo)下的細(xì)胞α-SMA、ColⅠ和E鈣蛋白mRNA的表達(dá) 隨著尿酸濃度的升高，α-SMA和ColⅠ的mRNA表達(dá)逐漸越高，而E鈣蛋白mRNA表達(dá)越低，詳見圖1。

2.2 實時定量PCR檢測不同尿酸濃度誘導(dǎo)下的細(xì)胞miR-101a和COX-2 mRNA的表達(dá) 隨著尿酸濃度的升高，miR-101a表達(dá)減少，COX-2 mRNA表達(dá)增多，詳見圖2。

圖1 不同尿酸濃度下α-SMA、ColⅠ和E鈣蛋白mRNA的表達(dá)（與0μmol/L組比較，*P＜0.05；與10μmol/L組比較，#P＜0.05；與100μmol/L組比較，△P＜0.05）

圖2 不同尿酸濃度下miR-101a和COX-2 mRNA的表達(dá)（與0μmol/L組比較，*P＜0.05；與10μmol/L組比較，#P＜0.05；與100μmol/L組比較，△P＜0.05）

2.3 Western blot檢測不同尿酸濃度誘導(dǎo)下的細(xì)胞α-SMA表達(dá)水平的比較 隨著尿酸濃度的升高，α-SMA表達(dá)水平越高，詳見表2和圖3。

表2 不同尿酸濃度下α-SMA蛋白的灰度值

圖3 不同尿酸濃度誘導(dǎo)下的細(xì)胞α-SMA的表達(dá)

2.4 Western blot檢測不同尿酸濃度誘導(dǎo)下的細(xì)胞COX-2的表達(dá) 隨著尿酸濃度的升高，COX-2的表達(dá)增多，詳見表3和圖4。

2.5 免疫熒光檢測不同尿酸濃度下ColⅠ的表達(dá) 隨著尿酸濃度的升高，ColⅠ表達(dá)水平越高，詳見圖5。

2.6 實時定量PCR測定轉(zhuǎn)染效果 轉(zhuǎn)染miR-101a mimics組miR-101a的表達(dá)量為122.33±27.67，較空白對照組（1.00±0.00）和陰性對照組（0.77±0.43）明顯升高（P＜0.05）。

表3 不同尿酸濃度下α-SMA蛋白的灰度值

圖4 不同尿酸濃度誘導(dǎo)下的細(xì)胞COX-2的表達(dá)

圖5 不同尿酸濃度下ColⅠ的表達(dá)（A：0 μmol/L；B：10 μmol/L；C：100 μmol/L；D：500 μmol/L）

2.7 實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組中E鈣蛋白、ColⅠ、α-SMA和COX-2 mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染miR-101a mimics組ColⅠ、α-SMA和COX-2 mRNA的表達(dá)量較空白對照組和陰性對照組明顯減少，而E鈣蛋白mRNA表達(dá)明顯增多（P＜0.05），空白對照組與陰性對照組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，詳見圖6。

圖6 轉(zhuǎn)染后各組中E鈣蛋白、ColⅠ、α-SMA和COX-2 mRNA的表達(dá)（與空白對照組比較，*P＜0.05）

2.8 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后各組中COX-2和α-SMA表達(dá)水平的比較 轉(zhuǎn)染miR-101a mimics組COX-2和 α-SMA的表達(dá)量較空白對照組和陰性對照組明顯減少（P＜0.05），而空白對照組和陰性對照組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表4和圖7。

表4 轉(zhuǎn)染后各組中COX-2及α-SMA灰度值的比較

圖7 轉(zhuǎn)染后各組中COX-2和α-SMA的表達(dá)

2.9 免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染后各組ColⅠ的表達(dá) 轉(zhuǎn)染miR-101a mimics組ColⅠ的表達(dá)量較空白對照組和陰性對照組明顯減少，詳見圖8。

圖8 不同尿酸濃度下ColⅠ的表達(dá)（A：miR-101a組；B：空白對照組；C：陰性對照組）

3 討論

高尿酸血癥長期以來一直被認(rèn)為是腎功能不全的表現(xiàn)之一，近年來越來越多的研究表明高尿酸血癥也是導(dǎo)致腎功能不全發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。有臨床資料顯示，在血壓正常的個體血清尿酸水平是腎功能下降的獨立危險因素[6]。一項關(guān)于21 475例健康志愿者的臨床調(diào)查研究顯示，尿酸升高是腎臟疾病新的獨立危險因素[7]。許多與腎臟疾病相關(guān)的危險因素都直接影響腎小管的結(jié)構(gòu)或功能。一些促纖維基因或炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化，后者是以α-SMA表達(dá)增多及E鈣蛋白表達(dá)減少為特征的表型轉(zhuǎn)化，這種表型轉(zhuǎn)化與腎臟纖維化密切相關(guān)。

本實驗證明尿酸可能誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，且呈濃度依賴性。Ryu等[8]研究表明尿酸通過活化Snail和Slug蛋白促進(jìn)E鈣蛋白合成減少降解增多，從而誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。另外，尿酸還可以同誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及局部炎癥反應(yīng)，激活局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，從而引起腎臟損害[9]。COX-2是公認(rèn)的重要促炎介質(zhì)之一，介導(dǎo)前列腺素類炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，當(dāng)受到炎癥刺激時，COX-2被誘導(dǎo)處于高表達(dá)水平。體外研究表明，一定高濃度的尿酸能直接誘導(dǎo)腎臟系膜細(xì)胞合成COX-2和前列腺素E2（PGE2）的增加，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[10]。而炎癥反應(yīng)被證實與EMT發(fā)生密切相關(guān)，尤其表現(xiàn)在器官纖維化及腫瘤的發(fā)生等方面[11]。有研究報道，miR-101a與COX-2基因的3＇UTR區(qū)序列互補配對并與之結(jié)合從而抑制該基因的表達(dá)，提示COX-2可能為miR-101a靶基因之一[12]。Tanaka等[13]通過實驗證實帶有熒光標(biāo)記的COX-2 3＇URT區(qū)域的報告結(jié)構(gòu)基團(tuán)，起熒光活性能被miR-101a顯著抑制，說明miR-101a能直接與COX-2的3＇URT直接結(jié)合，強烈推測COX-2是miR-101a的靶基因之一。本實驗用尿酸誘導(dǎo)上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ColⅠ和α-SMA表達(dá)升高，而E鈣蛋白表達(dá)降低，并呈濃度依賴性，表明尿酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，而同時我們也檢測到miR-101a表達(dá)下調(diào)，而COX-2表達(dá)上調(diào)，提示尿酸誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT可能和miR-101a與COX-2相關(guān)，COX-2參與促進(jìn)EMT，而miR-101a可能參與其中的調(diào)節(jié)。進(jìn)一步我們設(shè)計實驗，體外腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染miR-101a，發(fā)現(xiàn)COX-2、α-SMA、ColⅠ表達(dá)明顯減少，而E鈣蛋白表達(dá)增多，提示miR-101a能抑制尿酸誘導(dǎo)的腎小管轉(zhuǎn)分化，實驗結(jié)果支持miR-101a可能參與尿酸誘導(dǎo)EMT的調(diào)節(jié)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示尿酸可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，并呈濃度依賴性，且可能與尿酸引起的局麻炎癥反應(yīng)相關(guān)，miR-101a及COX-2參與其中的調(diào)節(jié)作用。本研究闡述了尿酸導(dǎo)致腎臟損害的另一個可能的潛在機制，但具體機制尚有待進(jìn)一步的研究。

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Roles of microRNA-101a in epithelial-mesenchymal transition of rat renal tubular epithelial cells induced by uric acid

Objective To investigate the role of microRNA-101a (miR-101a)in epithelial-mesenchymal transition (EMT)of rat renal tubular epithelial cells induced by uric acid．Methods Cultured renal tubular epithelial NRK-52E cells were treated with medium containing various concentration of uric acid(0 μmol/L,10 μmol/L,100 μmol/L,500 μmol/L)．The expression of α-smooth muscle actin(α-SMA)mRNA and protein was detected by real time PCR and Western Blot,expression of collagen I(ColⅠ)mRNA and protein by real time PCR and immunofluorescence,and expression of E-cadherin mRNA by real time PCR．The expression of miR-101a,cycloxygenase-2(COX-2)was detected by real time PCR or Western Blot．Before treated with 100 μmol/L uric acid,the cultured NRK-52E cells were transfected with miR-101a(miR-101a group),transfected with randomly synthesized miRNA (negative control group)or not transfected(blank control group)．Real time PCR was preformed to examine efficiency of transfection．Then the expression of α-SMA,ColⅠ,E-cadherin and COX-2 was determined．Results With the increasing of uric acid concentration,the expression of α-SMA and ColⅠwas increased，and E-cadherin decreased,while the expression of miR-101a decreased and COX-2 increased．The expression of α-SMA,ColⅠand COX-2 in miR-101a group was significantly decreased,E-cadherin increases,compared with blank control group and negative control group(P＜0．05), while there was no significant difference between the latter two groups．Conclusion Uric acid induces EMT of rat real tubular epithelial NRK-52E cells in a concentration-dependent manner,miR-101a and inflammation may be involved in EMT of NRK-52E cells induced by uric acid．

Uric acid MicroRNA-101a Cycloxygenase-2 Epithelial-mesenchymal transition Renal tubular epithelial cells

2014-07-23）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

325027 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科（葉菡洋、陳琰、李占園、金領(lǐng)微、鄭育、王紅、周志宏），內(nèi)分泌科（金建）

周志宏，E-mail：markzhou@wzhealth.com