林海鴻 姜平 屠洋洋 林憲慧 徐濤 羅順斌 余俊華 蔡劍平 鄭志強(qiáng)

兩種不同類型的胃癌組織中DNA氧化損傷的水平及臨床意義

林海鴻 姜平 屠洋洋 林憲慧 徐濤 羅順斌 余俊華 蔡劍平 鄭志強(qiáng)

目的 檢測(cè)胃腺癌、印戒細(xì)胞癌組織及正常胃黏膜組織中8-羥基脫氧鳥苷（8-oxodGsn）水平，探討DNA氧化損傷與不同類型胃癌臨床指標(biāo)間的關(guān)系。方法 提取42例胃癌（腺癌28例，印戒細(xì)胞癌14例）及癌旁5cm以外的正常組織的DNA，并采用核酸酶P1和堿性磷酸酶消化成單個(gè)核苷，再采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）檢測(cè)其8-oxodGsn的水平；同時(shí)聯(lián)合免疫組化法對(duì)組織中的8-oxodGsn進(jìn)行定位分析。結(jié)果 不同類型胃癌組織與正常組織中8-oxodGsn水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。8-oxodGsn主要分布于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，腺癌細(xì)胞中以細(xì)胞核分布居多，印戒細(xì)胞癌中以細(xì)胞質(zhì)分布居多。不同類型胃癌組織中8-oxodGsn水平在癌組織浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移程度、臨床病理分期等差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。結(jié)論 8-oxodGsn水平在兩種類型的胃癌組織中均有不同程度的增加，提示DNA氧化損傷可能是胃癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素。

8-oxodGsn 胃腺癌 印戒細(xì)胞癌 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

氧化應(yīng)激在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色，尤其是DNA的氧化。當(dāng)過強(qiáng)的氧化刺激因素，諸如紫外線、生化及生物損傷等造成DNA上的堿基發(fā)生氧化后，未能及時(shí)修復(fù)的DNA氧化損傷會(huì)顯著增加體內(nèi)突變率。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在著高水平的氧化損傷，在多種腫瘤組織中均檢測(cè)到高水平的8-羥基脫氧鳥苷（8-oxodGsn）[1]。胃癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜、多因素的過程，DNA氧化損傷是導(dǎo)致胃癌發(fā)生的原因之一[2]。目前，關(guān)于不同類型的胃癌組織中DNA的氧化損傷程度是否相同尚未清楚。筆者采用LC-MS/MS定量方法和免疫組化定位方法對(duì)常見類型的胃癌組織及正常胃黏膜組織中的8-oxodGsn水平進(jìn)行檢測(cè)，探討DNA氧化產(chǎn)物8-oxodGsn在這兩種不同類型胃癌組織中的水平及其與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料及標(biāo)本 [13C，15N2]8-oxodGsn（加拿大Toronto Research Chemicals公司），[15N5]dGsn（美國Cambridge Isotope Laboratories公司），甲磺酸去鐵銨（DFOM）（美國Sigma-Aldrich公司），TRIzol（美國Invitrogen公司），蛋白酶K（美國AMERESCO公司），核酸酶P1（日本W(wǎng)AKO公司），堿性磷酸酶（美國NEB公司），小鼠抗8-oxoGsn單克隆抗體（美國Abcam公司），山羊抗小鼠IgG抗體（北京康為世紀(jì)有限公司），RNase-free DNase I（日本Takara公司），色譜級(jí)甲醇、乙腈、醋酸銨（美國Fisher Scientific公司），免疫組化試劑盒PV6000、DAB顯色劑、抗體稀釋液、伊紅、蘇木素、丙酮（北京中衫金橋生物科技有限公司），異丙醇、氯仿、乙醇、冰醋酸等試劑均為分析純（北京化學(xué)試劑有限公司）。Agilent1290高效液相儀，Agilent6490質(zhì)譜儀。所有組織標(biāo)均本來自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科，其中胃癌組織42例，包括腺癌28例和印戒細(xì)胞癌14例，對(duì)照組組織為所對(duì)應(yīng)同一例患者癌旁5cm以外的正常組織。

1.2 DNA的提取、消化及質(zhì)譜檢測(cè) DNA的抽提和消化按照歐洲D(zhuǎn)NA氧化損傷標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（ESCODD）推薦的操作方法[3]，在此過程中加入DFOM來降低DNA人為氧化水平。抽提得到的DNA需要進(jìn)一步消化成單個(gè)核苷用于質(zhì)譜檢測(cè)，具體步驟如下：取20μg DNA，用1mmol/L的DFOM溶液定容至79μl，100℃金屬浴變性3min，立即冰上冷卻，加入10μl核酸酶P1(1U/μl)，再37℃水浴孵育2h，加入11μl堿性磷酸酶稀釋液[其中包括1μl堿性磷酸酶（10U/μl）和10μl buffer（10X）]，37℃水浴孵育1h，離心（10 000g，10min，4℃），取90μl上清液于內(nèi)插管中，加入5μl[13C，15N2]8-oxodGsn（20pg/μl）和2μl[15N5]dGsn（0.25ng/μl），吹打混勻。直接進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)或者-80℃保存。液相色譜條件和質(zhì)譜條件如Gan等[4]所描述。

1.3 方法 水化組織切片5min，RNA酶處理1h，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，3mol/L鹽酸變性5min，再放入1mol/L Tris-base溶液中5min，PBS清洗，加入山羊血清封閉30min，甩去血清，再滴加一抗（小鼠抗8-oxodGsn單克隆抗體），4℃孵育過夜，并設(shè)立對(duì)照，以PBS代替一抗為陰性對(duì)照，PBS振洗再依次滴加二抗（山羊抗小鼠IgG抗體）及辣根過氧化物酶標(biāo)記的顯色底物，DAB染色，甲基綠復(fù)染，脫水，透明后中性樹膠封片。

1.4 臨床分期 參照美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）的制定第7版腫瘤分期手冊(cè)[5]。

1.5 結(jié)果判斷 隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，觀察8-oxodGsn在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的著色情況，并進(jìn)一步分析細(xì)胞核著色及細(xì)胞質(zhì)著色細(xì)胞所占百分比或個(gè)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和正常組織間8-oxodGsn水平的比較 見圖1。

圖1 胃癌組織和正常組織中8-oxodGsn水平的比較（A：胃癌旁正常組織；B：胃癌組織；A1：印戒細(xì)胞癌旁正常組織；B1：印戒細(xì)胞癌組織；A2：胃腺癌旁正常組織；B2：胃腺癌組織。與正常組織比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖1可見，正常組織中8-oxodGsn水平均明顯高于胃癌組織（均P＜0.01）。

2.2 胃腺癌與印戒細(xì)胞癌組織的免疫組化結(jié)果 8-oxodGsn主要分布于胃癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，在腺癌組織中以細(xì)胞核相對(duì)較多，細(xì)胞質(zhì)較少，而在印戒細(xì)胞癌中則以細(xì)胞質(zhì)居多，細(xì)胞核稍少，詳見圖2、3。

圖2 腺癌中8-oxodGsn的表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖3 印戒細(xì)胞癌中8-oxodGsn的表達(dá)（免疫組化染色，×400）

2.3 8-oxodGsn水平與臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

由表1可見，年齡≥56歲與＜56歲患者在腺癌和印戒細(xì)胞癌中8-oxodGsn水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），不同性別的腺癌和印戒細(xì)胞癌患者中8-oxodGsn水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。無論是腺癌還是印戒細(xì)胞癌，未浸潤到漿膜層的癌組織中8-oxodGsn水平明顯低于浸潤到漿膜的癌組織，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中8-oxodGsn水平要比未轉(zhuǎn)移的高，臨床病理分期4期比3期高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 8-oxodGsn水平與臨床病理特征的關(guān)系（%）

3 討論

胃組織DNA氧化與其組織固有層的炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧簇（ROS）密切相關(guān)，在氧化過程中產(chǎn)生過量的ROS可以攻擊臨近細(xì)胞的細(xì)胞核和線粒體DNA，從而導(dǎo)致上述細(xì)胞DNA損傷。持續(xù)的氧化應(yīng)激在癌癥發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，這就是癌癥發(fā)病機(jī)制的持續(xù)氧化學(xué)說。雖然該學(xué)說中的具體細(xì)胞或分子機(jī)制，例如是否通過慢性炎癥的積累還不很清楚，但已有的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激DNA損傷是胃癌的發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要因素[6]。

本研究通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，兩種不同類型的胃癌組織中8-oxodGsn在細(xì)胞內(nèi)的分布狀況不同：在印戒細(xì)胞癌組織中，細(xì)胞質(zhì)中8-oxodGsn水平較多，細(xì)胞核相對(duì)較少，這與以前的研究結(jié)果相一致，其原因可能是線粒體的DNA缺乏蛋白質(zhì)保護(hù)，對(duì)自由基攻擊更加敏感，且DNA修復(fù)率低，因此線粒體DNA比細(xì)胞核DNA更容易發(fā)氧化[7-8]。本研究中發(fā)現(xiàn)，腺癌組織中8-oxodGsn的分布與印戒細(xì)胞癌組織中的分布相反，即細(xì)胞核中8-oxodGsn水平較多，而細(xì)胞質(zhì)少。筆者認(rèn)為這可能與腺癌的DNA氧化水平程度較印戒細(xì)胞癌水平更高是有一定聯(lián)系的。

8-oxodGsn作為一個(gè)普遍存在的DNA氧化損傷標(biāo)志物，國外研究發(fā)現(xiàn)8-oxodGsn與癌癥的發(fā)生存在著緊密的聯(lián)系[9]，可能是由于損傷DNA沒有被及時(shí)修復(fù)致使損傷DNA累積引起基因突變。在腫瘤組織中的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織中的水平，并且8-oxodGsn的高表達(dá)與很多腫瘤的預(yù)后不佳密切相關(guān)[8，10-12]。因此，8-oxodGsn作為一種氧化突變分子，可能是導(dǎo)致基因突變和細(xì)胞癌變的原因之一，從這個(gè)角度講，8-oxodGsn檢測(cè)很可能可以用于評(píng)價(jià)不同種類胃癌易感人群的預(yù)警和抗氧化治療效果，并且有助于我們更好地判斷胃癌患者的預(yù)后。

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8-oxodGsn levels in gastric adenocarcinoma and signet ring cell carcinoma

Objective To investigate oxidative DNA damage in gastric adenocarcinoma,signet ring cell carcinoma and normal gastric mucosa by detecting 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGsn)levels．Methods Specimens of gastric cancer tissues and normal gastric mucosa were obtained from 28 cases of adenocarcinoma and 14 cases of signet ring cell carcinoma．The DNA was extracted from tissue specimens and digested by nuclease P1 and alkaline phosphatase．The levels of 8-oxodGsn were determined by LC-MS/MS method and the expression of 8-oxodGsn in tissue was detected by immunohistochemical method．Results There was a significant difference in 8-oxodGsn levels between gastric cancer and normal gastric mucosa(P＜0．05)．Immunohistochemical staining showed that 8-oxodGsn was mainly distributed in nucleus in gastric adenocarcinoma,while mainly in cytoplasm in signet ring cell carcinoma．The expression levels of 8-oxodGsn were significantly correlated with invasion depth,lymph node metastasis,distant metastasis and clinical staging of gastric cancer(all P＜0．05)．Conclusion 8-oxodGsn levels are increased in gastric adenocarcinoma and gastric signet ring cell carcinoma in different extend,which suggested that oxidative DNA damage may be an important factor in the development of gastric cancer．

8-oxodGsn Gastric adenocarcinoma Signet ring cell carcinoma LC-MS/MS

2014-08-18）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

325027 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科（林海鴻、屠洋洋、林憲慧、余俊華），藥理教研室（羅順斌、徐濤）；衛(wèi)生部北京醫(yī)院（蔡劍平、姜平）

鄭志強(qiáng)，E-mail：zhe_zhi2000@yahoo.com.cn