岳嘉蘋，王少輝，韓先干，白 灝，王小蘭，侯灣灣，于圣青

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

鴨疫里默氏桿菌10個基因在菌株中的分布及序列分析

岳嘉蘋，王少輝，韓先干，白 灝，王小蘭，侯灣灣，于圣青

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

檢測鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer, RA）10個基因在不同菌株間的分布并進(jìn)行序列分析，研究其在不同菌株中的保守性。分別選取8株RA的10個基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆于pMD18-T載體，進(jìn)行序列測定和分析。結(jié)果顯示：測定的8株RA菌株中均能檢測到Lipid A、LuxE和TCTR編碼基因，表明這些基因在不同血清型RA菌株中的保守性良好；TR基因僅從6株具有致病性的RA菌株中擴(kuò)增得到，而2株非致病性RA菌株NJ1和NJ4未能擴(kuò)增到，表明TR基因可能與RA菌株的致病性相關(guān)；IS1僅從6株血清1型和2型的RA菌株擴(kuò)增得到，2株血清10型菌株均未擴(kuò)增得到，提示IS1為血清10型菌株缺失基因。

鴨疫里默氏桿菌；PCR；序列分析

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer, RA）病是當(dāng)前危害我國養(yǎng)鴨業(yè)最重要的傳染病之一，廣泛分布于世界上各個養(yǎng)鴨國家[1]。1～8周齡鴨對本菌易感，尤以2～3周齡的鴨最易感，主要引起纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎等廣泛纖維素性炎癥，部分病鴨表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀、干酪性輸卵管炎和生長障礙。

RA菌株的血清型較多，到目前為止，共報道有21個血清型（1～21 型）[2-9]，各血清型之間無交叉保護(hù)[2]。RA菌株的致病性各異，部分菌株對易感鴨無致病性，其LD50大于1010CFU，而有些菌株的致病力很強(qiáng)，其LD50可低至100 CFU[10-12]，血清型和致病性之間無相關(guān)性。

自1982年郭玉璞等[13]在北京確定血清1型的鴨疫里默氏桿菌感染后，我國各養(yǎng)鴨地區(qū)不斷有出現(xiàn)鴨疫里默氏桿菌感染的報道。張大丙等[14-27]鑒定出我國還有血清 2、6、10、11、13、14 型和其他未知血清型的存在，表明我國存在的RA血清型具有一定的復(fù)雜性。在我國大部分的鴨場，感染鴨疫里默氏桿菌的發(fā)病率高達(dá)50%以上，死亡率可達(dá)到80%。然而，我們對鴨疫里默氏桿菌的毒力因子和發(fā)病機(jī)制卻知之甚少。因此，本文旨在通過對不同血清型鴨疫里默氏桿菌的10個相對保守基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及序列測定分析，研究這些基因在不同血清型菌株之間的分布和保守性是否呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)條件鴨疫里默氏桿菌血清1型菌株CH3、WJ4、NJ1、NJ4，血清2型菌株Yb2、NJ3，血清10型菌株Hxb2、YxL1由本實驗室分離、鑒定并保存。鴨疫里默氏桿菌由TSB（胰蛋白胨大豆肉湯）或TSA（胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂）在37 ℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)。宿主菌E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司。詳見表1。

1.2 培養(yǎng)基和緩沖液配制TSB液體培養(yǎng)基：稱取30 g胰蛋白胨大豆肉湯粉于1 L超純水中，121 ℃高壓滅菌15 min；TSA固體培養(yǎng)基：稱取30 g胰蛋白胨大豆肉湯粉于1 L超純水中，然后加入12 g瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌15 min。LB液體培養(yǎng)基：稱取10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物和10 g氯化鈉于1 L超純水中121 ℃高壓滅菌15 min；LB固體培養(yǎng)基：稱取10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物和10 g氯化鈉于1 L超純水中，然后加入12 g瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌15 min。去離子水：1 mL/管分裝后，121 ℃高壓滅菌20 min，－20 ℃保存?zhèn)溆茫?0×TAE緩沖液：冰乙酸57.1 mL，Tris-base 242 g，100 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）定容至1 L；1%瓊脂糖凝膠：1g瓊脂糖溶解于100 mL 1×TAE緩沖液中，微波爐加熱煮沸，溫度降至60 ℃時加入2 μL Goldview，混勻備用。

1.3 主要試劑和儀器設(shè)備胰酶大豆瓊脂和胰酶大豆肉湯為BD公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Master Mix、定量Marker DS-2000均購自北京康維科技有限公司；高保真酶購自TaKaRa公司；自動高壓滅菌鍋：日本TOMY公司；恒溫箱：德國 Binder公司；超凈臺：上海博訊公司；CO2培養(yǎng)箱：美國SIM公司；恒溫培養(yǎng)搖床：北京創(chuàng)新思成公司；PCR儀：美國ABI公司；DNA電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司；超低溫冰箱：美國Nuair公司。

1.4 基因選擇、引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中鴨疫里默氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株DSM 15868株的全基因組序列（序列號CP002346.1），選取10個保守基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及序列測定。引物用軟件Primer 5.0設(shè)計，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成并純化，詳見表2。

1.5 PCR擴(kuò)增體系PCR 擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上游引物和下游引物各1 μL，模板2 μL，用無菌去離子水補(bǔ)至終體積20 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸1.2 min，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min；同時設(shè)不加模板的陰性對照。取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.6 PCR產(chǎn)物純化和克隆用Thermo膠回收試劑盒對所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物與pMD18-T simple載體連接后轉(zhuǎn)化至E. coliDH5α中，這一過程參照分子克隆實驗指南進(jìn)行[28]。經(jīng)SalI與BamH I酶切鑒定篩選可疑陽性克隆，并用PCR進(jìn)一步鑒定。取各基因產(chǎn)物經(jīng)酶切和PCR鑒定均為陽性的2～3個重組菌液送至上海華津生物科技有限公司測序。

1.7 序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的建立序列測定完成后，用DNAStar軟件進(jìn)行同源性的比較分析并建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

A、LuxE和TCTR編碼基因，表明這些基因在不同血清型RA菌株中的保守性良好；TR基因僅從6株具有致病性的RA菌株中擴(kuò)增得到，而2株非致病性[11]RA菌株NJ1和NJ4未能擴(kuò)增到，表明TR基因可能與RA菌株的致病性相關(guān)；IS1僅從6株血清1型和2型的RA菌株擴(kuò)增得到，2株血清10型菌株均未擴(kuò)增得到。提示IS1基因可能與RA菌株的血清型相關(guān)。結(jié)果見表3。

2.1 PCR擴(kuò)增測定的8株RA菌株均能檢測到Lipid

表3 10個基因在RA 不同菌株中的PCR擴(kuò)增結(jié)果Table 3 The distribution of ten genes in RA strains

2.2 PCR產(chǎn)物的克隆和鑒定用Thermo PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒分別將8株細(xì)菌10個基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。用SalI和BamH I雙酶切后與pMD18-T simple載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5α，分別取3～5個白色單菌落進(jìn)行PCR鑒定[28]。結(jié)果所有樣品均為PCR擴(kuò)增陽性結(jié)果，表明基因擴(kuò)增產(chǎn)物已成功克隆至載體中。

2.3 序列測定與分析分別取各基因擴(kuò)增產(chǎn)物的3個陽性重組菌液送至上海華津生物科技有限公司測序，采用DNAStar軟件中的MegAlign程序進(jìn)行序列比對（By clustal W Method），結(jié)果表明，陽性擴(kuò)增基因序列與鴨疫里默氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DSM15868相對應(yīng)序列的同源性均達(dá)到90%以上；RADSM15868菌株基因序列與血清2型菌株Yb2和NJ3的基因序列相似性最高，除LuxC基因外，其余9個基因的同源性均達(dá)到97%以上；8個RA菌株均擴(kuò)增獲得Lipid A、LuxE和TCTR基因產(chǎn)物，表明該3個基因在RA菌株中的保守性良好。結(jié)果見表4。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的繪制使用DNAStar軟件中的MegAlign程序進(jìn)行序列比對（By clustal W Method），繪制得到系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明：兩株非致病性菌株NJ1和NJ4在CEAH、Lipid A、LuxE、IS1和TCTR基因進(jìn)化樹中均位于同一分支，表明這些基因與細(xì)菌的致病性可能相關(guān)；血清1型菌株CH3和WJ4，血清2型菌株NJ3和Yb2在 TR、LuxE、IS1、TCTR、Luxr1、AMT基因進(jìn)化樹中均位于各自的分支，表明這些基因與細(xì)菌的血清型可能相關(guān)；DSM15868在大多數(shù)基因進(jìn)化樹中與血清2型菌株位于同一分支，提示該菌株為血清2型菌株。如圖1。

表4 10個基因在RA不同菌株中的序列同源性分析Table 4 The homology analysis of the ten genes in RA strains

3 討論

鴨疫里默氏桿菌于1932年由Hendrickson和Hilbert首次分離獲得[29]，在1997年被歸類于黃桿菌科第五核糖體RNA總科[30]。2011年8月，GenBank上登錄了RA的第一個全基因組序列ATCC11845（No. CP003388.1）[31]，此后又有4株鴨疫里默氏桿菌的全基因組序列登錄至GenBank，然而對于許多基因的功能并沒有明確的注釋。本文對8株不同血清型鴨疫里默氏桿菌的10個相對保守基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，研究各基因在不同菌株中的分布情況，發(fā)現(xiàn)Lipid A、LuxE和TCTR這3個基因在不同血清型的RA菌株中具有高度的保守性。表明這3個基因可能與鴨疫里默氏桿菌的特定生物學(xué)特性相關(guān)。

鴨疫里默氏桿菌的血清型眾多，各個血清型之間缺乏有效的交叉保護(hù)[2]，且血清型與毒力之間并沒有相關(guān)性。因此對于鴨疫里默氏桿菌病的流行目前尚缺乏有效的防治措施。本文通過對10個相對保守基因在8株不同血清型鴨疫里默氏桿菌中的序列進(jìn)行測定并進(jìn)行進(jìn)化樹繪制。結(jié)果表明TR、LuxE、IS1、TCTR、Luxr1、AMT基因序列與細(xì)菌的血清型具有一定的相關(guān)性。因此我們可以基于這些基因序列建立特異性地鑒定鴨疫里默氏桿菌血清型的PCR方法，從而對臨床病例進(jìn)行快速的血清型鑒定，對制定合理、有效的鴨疫里默氏桿菌病的防治方法奠定了基礎(chǔ)。

近幾年，有關(guān)RA分子致病機(jī)制的研究主要是對毒力基因進(jìn)行鑒定，然而目前已報道的RA毒力因子僅有ompA基因。而本文的研究表明CWAH、Lipid A、LuxE、IS1和TCTR基因與細(xì)菌的致病性可能相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)對鴨疫里默氏桿菌的分子致病機(jī)制研究提供了方向。事實上我們正在構(gòu)建相關(guān)基因的缺失株對其致病性進(jìn)行驗證。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了鴨疫里默氏桿菌3個具有高度保守性的基因、6個可能與血清型相關(guān)的基因，以及5個可能為毒力相關(guān)的基因，該結(jié)果為進(jìn)一步鴨疫里默氏桿菌病的防控和鴨疫里默氏桿菌的致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

圖1 10個基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 phylogenetic trees of 10 genes investigated

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DISTRIBUTION AND SEQUENCE ANALYSIS OF TEN GENES IN RIEMERELLA ANATIPESTIFER STRAINS

YUE Jia-ping, WANG Shao-hui, HAN Xian-gan, BAI Hao, WANG Xiao-lan, HOU Wan-wan, YU Sheng-qing
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Investigation into distribution and sequences of 10 genes inRiemerella anatipestiferstrains will be informative to speculate the conservation of these genes. Ten genes were amplif ed in PCR from eight strains of R. anatipestifer. The PCR products were then cloned into PMD18-T vector for sequence analysis. Among 10 genes, Lipid A, LuxE and TCTR were amplif ed from all eight strains tested, indicating that these genes were well conserved in R. anatipestifer strains belonging to different serotypes. The TR gene was detected only in six pathogenic strains of R. anatipestifer but not in two non-pathogenic R. anatipestifer strains NJ1 and NJ4, suggesting that TR gene might be related to bacterial pathogenecity. The IS1 gene was amplif ed from six strains of serotypes 1 and 2 but not from two strains of serotype 10, supporting that IS1 was absent from R. anatipestifer strains of serotype 10.

Riemerella anatipestifer; PCR; sequence analysis

S852.612

A

1674-6422（2014）01-0050-07

2013-12-19

國家自然科學(xué)基金面上項目（31272591，31072161）

岳嘉蘋，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

于圣青，E-mail：yus@shvri.ac.cn