鄧振興，孔維信，張林，孫懷鑫，丁露露

（1．江蘇大學臨床醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212001；2．上海交通大學醫(yī)學院蘇州九龍醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇蘇州215021）

Tbxa2r基因敲低對嘌呤霉素氨基核苷誘導的足細胞凋亡的影響

鄧振興1，2，孔維信2，張林2，孫懷鑫2，丁露露2

（1．江蘇大學臨床醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212001；2．上海交通大學醫(yī)學院蘇州九龍醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇蘇州215021）

目的：觀察足細胞血栓素A2受體（Tbxa2r）基因敲低對嘌呤霉素氨基核苷（puromycin aminonucleoside，PAN）誘導的足細胞凋亡的影響。方法：通過目標序列設計4條siRNA，評價細胞轉染效率后，RT-PCR檢測siRNA干擾效果，蛋白質印跡法檢測Tbxa2r蛋白表達，流式細胞儀檢測PAN誘導的MPC5足細胞的凋亡情況。結果：目標序列在轉染24 h后幾乎沒有干擾效果，而在48 h時第3條siRNA（Tbxa2r-mus-1677）干擾序列作用效果最好；在干擾72 h后，Tbxa2r蛋白表達量明顯降低。PAN刺激48 h后，空白組與陰性對照組MPC5足細胞沒有明顯的凋亡現(xiàn)象，陽性對照組與Tbxa2r基因敲低PAN組細胞凋亡和壞死現(xiàn)象明顯。結論：PAN能促進Tbxa2r基因敲低的足細胞發(fā)生凋亡和壞死。

足細胞；血栓素A2受體；細胞凋亡

血栓素A2（Thromboxane A2，TXA2）是花生四烯酸代謝過程中生成的具有很強生理活性的產(chǎn)物［1－2］，其與特異TXA2受體（TP受體或Tbxa2r）結合，誘導血小板聚集，收縮血管，參與血管緊張素Ⅱ依賴的高血壓的發(fā)生、糖尿病腎病的進展、內(nèi)毒素性小鼠及5／6腎大部切除腎衰竭的發(fā)生［3］。

研究表明，多柔比星能選擇性增加小鼠腎小球足細胞前列腺素E2（PGE2）受體亞型EP4及Tbxa2r的表達［4］。將過表達足細胞環(huán)氧合酶2（COX-2）的轉基因小鼠與Tbxa2r基因敲除小鼠雜交，則其后代對多柔比星損傷增加的敏感性可以逆轉；而將足細胞過表達COX2的轉基因小鼠選擇性敲除足細胞EP4基因，并未對足細胞起保護作用［5］。推測Tbxa2r可能與COX2過表達的足細胞損傷有一定關聯(lián)。但Tbxa2r基因敲除對足細胞的影響尚無體外實驗報道。因此，我們采用Tbxa2r特異性小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術將足細胞Tbxa2r基因敲除或敲低，觀察嘌呤霉素氨基核苷（puromycin aminonucleoside，PAN）對其凋亡的影響。

1 材料和方法

1．1 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、Trizol、重組γ-干擾素（γ-IFN）購自美國Sigma公司；反轉錄試劑盒和Taq DNA聚合酶、轉染試劑Metafectene購自德國Biontex公司；兔抗小鼠Tbxa2r多克隆抗體、FITC標記的羊抗兔IgG和TRITC標記的羊抗兔IgG購自美國KPL公司；小鼠抗大鼠3磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔IgG、兔抗羊IgG、羊抗小鼠IgG購自上海華美生物工程公司。

1．2 足細胞培養(yǎng)

條件永生性小鼠足細胞（MPC5）由美國Mount Sinia醫(yī)學院Peter Mundel教授饋贈。參照文獻［6］方法進行培養(yǎng)。

1．3 目標序列的設計

Tbxa2r基因（Accession：NM＿009325．3，GI：142378599）序列從mRNA的AUG起始密碼開始，尋找“AA”序列，并記下其3′端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。研究顯示，GC含量在30%～50%左右的siRNA要比GC含量偏高的更為有效［7］。用軟件Genepharma Designer 2．0輔助設計4條干擾序列，見表1。

1．4 足細胞轉染效率評價實驗

干擾效果的好壞取決于siRNA進入細胞的數(shù)量和siRNA本身的性質，即細胞轉染效率評價。針對小鼠MPC5足細胞，由于不能判斷該細胞是否能進行脂質體轉染，在實驗前先進行轉染效率的評估。將熒光素FAM標記的siRNA以一定比例與陽離子脂質體混合，分別為0．25μL脂質體＋10 pmol siRNA，0．5μL脂質體＋10 pmol siRNA，0．5μL脂質體＋20 pmol siRNA。具體參照文獻［8］。

1．5 siRNA的轉染

參照文獻［9］。

1．6 總RNA的提取

棄培養(yǎng)液，每孔加入500μL Trizol，吹打細胞至完全裂解，轉移至EP管中，室溫放置10 min。加入100μL氯仿，劇烈振蕩混勻，室溫放置10 min。12 000×g，4℃離心10 min，取上清液至新EP管中，加入等體積異丙醇，室溫沉淀10 min。12 000× g，4℃離心15 min，棄上清。500μL 75%乙醇洗滌1次。12 000×g，4℃離心5 min，棄上清。常溫倒置晾干10 min。加入20μL DEPC溶解沉淀，測D（260 nm）、D（280 nm），計算RNA濃度。瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性。

1．7 RT-PCR檢測基因擴增

1．7．1 反轉錄反應體系 引物序列見表2。5×反轉錄緩沖液4μL，引物1．2μL（1μmol／L），RNA模板5μL，MMLV反轉錄酶0．2μL（200 U／μL），DEPC雙蒸水定容至20μL。42℃溫育45 min，85℃加熱10 min終止反應，冰上驟冷，反應液用作PCR模板。

1．7．2 內(nèi)參GAPDH和目標基因Tbxa2r反應體系2×RT-PCR混合物10μL，上、下游引物各0．1 μL（20μmol／L），cDNA模板2μL，r Taq DNA聚合酶0．4μL（5 U／μL），雙蒸水定容至20μL。1．7．3 反應條件 95℃變性3 min，95℃30 s，62℃40 s，共40個循環(huán)。

1．8 蛋白質印跡法檢測蛋白表達

參照文獻［9］。

1．9 流式細胞術檢測細胞凋亡

細胞隨機分為4組，即空白對照組、陰性轉染組、陰性轉染PAN組、Tbxa2r基因敲低PAN組。后2組各加入100μg／mL PAN刺激48 h，然后流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。

2 結果

2．1 MPC5足細胞轉染效率評價

通過熒光顯微鏡的觀察，判斷siRNA進入細胞的數(shù)量及細胞的生長狀態(tài)，結果顯示，當用0．25μL Lipo 2000／10 pmol siRNA轉染細胞時，轉染效率約為70%，此時細胞狀態(tài)與正常細胞基本一致，說明該濃度的轉染對細胞基本沒有影響；當用0．5μL Lipo 2000／10 pmol siRNA或0．5μL Lipo 2000／20 pmol siRNA轉染時，此時細胞出現(xiàn)皺縮或脫落，說明該濃度對細胞的生長影響較大，故采用0．25μL Lipo 2000／10 pmol siRNA進行下一步轉染實驗。見圖1。

2．2 目標序列的轉染及RT-PCR檢測干擾效果

2．2．1 PCR檢測干擾后的RNA 轉染試劑按照0．25μL脂質體＋10 pmol siRNA的比列，將合成的4條siRNA（表1）轉染MPC5細胞行干擾實驗，在24 h和48 h收集細胞樣品進行檢測。PCR擴增產(chǎn)物的電泳結果見圖2。各個基因均出現(xiàn)了擴增條帶。

2．2．2 熔解曲線檢測RT-PCR引物的特異性 結果如圖3所示。Tbxa2r引物擴增產(chǎn)物的熔解溫度為86～88℃，PPIA引物擴增產(chǎn)物的溶解溫度為82～86℃，GAPDH引物擴增產(chǎn)物的熔解溫度為86～ 88℃。熔解曲線和產(chǎn)物電泳圖結果說明，所用PCR引物的特異性良好，擴增的產(chǎn)物為目標基因。

2．3 熒光定量PCR擴增曲線檢測干擾效果

由熒光定量曲線起峰的結果可知，目標基因Tbxa2r的含量極低，熒光曲線起峰的位置在32個循環(huán)左右，而內(nèi)參基因PPIA和GAPDH的起峰位置都在16個循環(huán)左右。結果顯示，目標干擾序列在轉染后24 h幾乎沒有干擾效果；48 h時，對照樣品的起峰位置與24 h時相似，在30～32個PCR循環(huán)，而第3條siRNA（Tbxa2r-mus-1677）和第4條siRNA（Tbxa2r-mus-1884）干擾序列向后推遲了2個循環(huán)，起峰位置出現(xiàn)在32～34個循環(huán)，說明這兩條siRNA對目標序列存在一定的干擾效果。見圖4。

由計算結果得知，第3條siRNA（Tbxa2r-mus-1677）干擾48 h后2－ΔΔCt值最低，為0．18，所以，初步判定該干擾序列作用效果最好。干擾序列對內(nèi)參基因的含量影響不大，PPIA相對GAPDH的含量無論是在24 h還是在48 h都沒有受到影響。

2．4 蛋白質印跡法檢測蛋白表達

由圖5可知，GAPDH干擾質粒能降低GAPDH蛋白的表達量，但在48 h和72 h的相對表達量幾乎無改變。

在干擾72 h后，Tbxa2r蛋白表達量降低，說明干擾片段在72 h后影響蛋白的表達。見圖6。

蛋白質印跡結果與RT-PCR結果表明，第3條siRNA（Tbxa2r-mus-1677）在48 h時從mRNA水平下調mus-Tbxa2r的表達，在72 h時，從蛋白水平下調mus-Tbxa2r的表達。

2．5 PAN刺激后MPC5足細胞的凋亡情況

結果顯示，空白組和陰性對照組細胞沒有明顯的凋亡現(xiàn)象；陽性對照組細胞凋亡明顯增加，占23%，壞死細胞也大大增加，占19．5%。有效干擾片段組凋亡和壞死的細胞與陽性對照組相似，其中凋亡細胞約占28%，壞死細胞約為19．6%。以上結果說明，有效干擾片段在藥物刺激時，能促進細胞的凋亡和壞死。見圖7。

3 討論

足細胞是一種高度分化的細胞，不具有增殖特性，其損傷或丟失可導致大量蛋白尿或腎小球硬化。

Tbxa2r廣泛分布于不同組織器官的細胞膜及細胞內(nèi)結構上，由7個跨膜區(qū)、3個細胞外袢和3個細胞內(nèi)袢組成。Tbxa2r與其配體TXA2結合后，可以引起與受體偶聯(lián)的G蛋白發(fā)生變構，引發(fā)細胞內(nèi)一系列信息傳遞系統(tǒng)的變化而調節(jié)細胞代謝，引發(fā)血小板聚集和血管平滑肌收縮。研究表明，血栓素合成酶抑制劑或血栓素受體拮抗劑對鏈脲佐菌素誘導的腎損傷、狼瘡性腎炎、環(huán)孢素腎毒性、殘余腎及腎移植物排異均有療效，但作用機制尚不明確［10］。

我們采用Tbxa2r siRNA技術，獲得的siRNA和轉染試劑的適當比例為0．25μL脂質體＋10 pmol siRNA，成功地轉染進MPC5細胞進行干擾實驗。細胞培養(yǎng)48 h后，再用PAN（100μg／mL）刺激48 h，Tbxa2r基因敲低PAN組細胞出現(xiàn)明顯的凋亡和壞死，較陰性轉染組稍高?？瞻捉M與陰性轉染組細胞沒有明顯的凋亡現(xiàn)象。提示PAN可以誘導足細胞凋亡，Tbxa2r基因敲低可能加重足細胞的損傷；Tbxa2r是足細胞生存所依賴的，PAN的濃度、刺激時間及Tbxa2r的表達量與足細胞凋亡損傷的關系有待于進一步研究。

綜上所述，采用Tbxa2r特異性siRNA技術，能成功地將足細胞Tbxa2r基因敲低，且其敲低可加重足細胞的損傷。

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Effect of Tbxa2r gene knockdown on podocytes apoptosis induced by purom ycin am inonucleoside

DENG Zhen-xing1，2，KONGWei-xin2，ZHANG Lin2，SUN Huai-xin2，DING Lu-lu2
（1．Clinical School of Medicine，Jiangsu University，Jiangsu Zhenjiang 212001；2．Department of Nephrology，Suzhou Kowloon Hospital，Shanghai Jiao Tong University，Jiangsu Suzhou 215201，China）

Objective：To observe the effectof podocytes Tbxa2r gene knockdown on podocytes apoptosis induced by puromycin aminonucleoside（PAN）．M ethods：The interference effect was detected by RTPCR after designing the target sequence and evaluating the cell transfection efficiency．The expression of Tbxa2r protein wasmeasured by western blotting．The apoptosis of MPC5 cells induced by PAN was tested by flow cytometry．Results：Target sequence after 24 h transfection almost had no interference effects，and after 48 h，the third siRNA（Tbxa2r-mus-1677）had the best interference effect；after 72 h transfection，Tbxa2r protein expression was significantly reduced．PAN stimulated for 48 h，no significant MPC5 podocyte apoptosiswere observed in the control group and negative control group，while there were significant apoptosis and necrosis in the positive control group and Tbxa2r gene knockdown PAN group．Conclusion：The PAN might facilitate the apoptosis and necrosis in Tbxa2r gene knockdown podocytes．

podocyte；Tbxa2r；cell apoptosis

R329．25

A

1671－7783（2014）05－0384－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y130164

蘇州市科技計劃項目（SYSD2011070）；蘇州工業(yè)園區(qū)孵化項目

鄧振興（1981—），男，山東德州人，碩士，住院醫(yī)師，主要從事TXA-2與腎臟疾病關系的研究?？拙S信（通訊作者），E-mail：weixinkong＠hotmail．com

2013－07－26 ［編輯］劉星星