崔婷，宋冬明，裘影影，芮金兵，吳玲，費(fèi)小明，李晶，湯郁

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1．風(fēng)濕科，2．血液科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

MRL／lpr狼瘡鼠骨TNF-α／NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)

崔婷1，宋冬明1，裘影影1，芮金兵1，吳玲1，費(fèi)小明2，李晶1，湯郁1

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1．風(fēng)濕科，2．血液科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

目的：探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠（MRL／lpr）骨腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）／細(xì)胞核因子-κB p50（nuclear factor-κB p50，NF-κB p50）信號(hào)通路的表達(dá)。方法：選取C3He／HeJ小鼠（對(duì)照組）和MRL／lpr狼瘡小鼠（狼瘡組）各6只，飼養(yǎng)4個(gè)月后常規(guī)制備小鼠股骨組織切片，HE染色觀察骨質(zhì)情況，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)TNF-α、NF-κB p50蛋白表達(dá)情況；密度梯度離心法分離和貼壁法篩選骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs），然后培養(yǎng)；免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察BMMSCs中TNF-α、NF-κB p50表達(dá)情況。結(jié)果：與對(duì)照組比較，狼瘡組小鼠骨小梁松散，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，股骨TNF-α和NF-κB p50蛋白表達(dá)升高（P＜0．05或P＜0．01），BMMSCs中TNF-α和NF-κB p50蛋白表達(dá)亦升高（P＜0．05或P＜0．01）。結(jié)論：狼瘡鼠骨TNF-α／NF-κB信號(hào)通路處于異常活化狀態(tài)。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；間充質(zhì)干細(xì)胞；TNF-α／NF-κB信號(hào)通路

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種慢性的、系統(tǒng)性自身免疫病，累及全身多系統(tǒng)，包括腎臟、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌和皮膚等。近年來(lái)，隨著狼瘡治療水平的提高，患者的生存率也大幅度提高，但骨質(zhì)疏松成為影響患者生活質(zhì)量的主要問(wèn)題之一［1］。骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少，骨的微細(xì)結(jié)構(gòu)改變，骨的脆性增加致骨折發(fā)生率增加為特點(diǎn)的代謝病。骨代謝涉及多種信號(hào)通路，如細(xì)胞核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bonemorphogenetic protein，BMP）／Smad信號(hào)通路、有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路等。研究表明，SLE患者骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率高［2］。炎癥是導(dǎo)致SLE患者發(fā)生骨質(zhì)疏松的主要原因之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-10等炎癥因子主要通過(guò)細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)通路作用于破骨細(xì)胞，致其過(guò)度活化，進(jìn)而造成骨質(zhì)疏松［3］。但目前關(guān)于炎癥對(duì)SLE患者成骨細(xì)胞影響的研究甚少。因此，本研究旨通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討SLE骨TNF-α／NF-κB信號(hào)通路的改變。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物

MRL／lpr雌性狼瘡小鼠6只（狼瘡組），6～7周齡，體質(zhì)量（22．1～26．0）g，平均（24．2±0．5）g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：2007000560799。C3He／HeJ雌性小鼠6只（對(duì)照組），6～7周齡，體質(zhì)量（23．6～25．2）g，平均（24．7 ±0．7）g，購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物合格證編號(hào)201302035。小鼠均飼養(yǎng)于江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)條件相同，共4個(gè)月。

1．2 主要試劑、儀器

PBS（pH＝7．4）、低糖DMEM、胎牛血清（Gibco公司）；10%EDTA脫鈣液購(gòu)自北京羅基生物公司；兔抗鼠TNF-α多克隆抗體（Abcam公司）；兔抗鼠細(xì)胞核因子-κB p50（nuclear factor-κB p50，NF-κB p50）多克隆抗體（Santa Cruz公司）；兔源HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自福州邁新公司；細(xì)胞用玻片、24孔板（Corning公司）。

1．3 方法

1．3．1 骨組織HE染色 兩組小鼠采用過(guò)量乙醚吸入法處死。取左側(cè)股骨，剔除多余的肌肉組織，10%甲醛固定24 h，轉(zhuǎn)移至脫鈣液中，30 d后取出骨頭，制成4μm石蠟切片。切片脫蠟至水，伊紅染5 min，蘇木素染1 min，流水沖洗、鹽酸分化、溫水返藍(lán)、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1．3．2 骨組織免疫組織化學(xué)染色 切片脫蠟至水，PBS洗3次，5 min／次。3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，PBS沖洗5 min，3次。室溫下0．4%胃蛋白酶修復(fù)20 min，PBS洗3次，5 min／次。正常山羊血清室溫封閉20 min。分別滴加抗TNF-α、NF-κB p50一抗4℃過(guò)夜，PBS洗3次，5 min／次。滴加二抗室溫孵育30 min，PBS洗3次，5 min／次。滴加DAB，3min后自來(lái)水終止顯色。蘇木素復(fù)染1 min，分化、返藍(lán)、脫水、透明、封片，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1．3．3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）分離培養(yǎng) 采用密度梯度離心法和貼壁篩選法分離培養(yǎng)小鼠股骨BMMSCs。具體方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)［4］。

1．3．4 BMMSC免疫細(xì)胞化學(xué)染色 取兩組小鼠右側(cè)股骨骨髓，沖洗，得到的細(xì)胞用含15%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)，融合度達(dá)80%時(shí)用胰酶消化原代細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞做細(xì)胞玻片。24 h后棄培養(yǎng)液，10%甲醛固定15 min，PBS洗2次，0．5%Triton X-100孵育20 min，PBS洗2次。3% H2O2孵育15 min，PBS洗2次。正常山羊血清室溫封閉20 min。分別滴加抗TNF-α、NF-κB p50一抗4℃過(guò)夜。PBS洗2次，滴加二抗室溫孵育30 min。PBS洗2次。DAB顯色3min，自來(lái)水終止顯色。蘇木素復(fù)染1 min，分化、返藍(lán)、脫水、透明、封片，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用IPP軟件攝影，計(jì)算兩組小鼠骨皮質(zhì)厚度和骨小梁占髓腔體積的百分比；采用SPSS 16．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示。方差齊時(shí)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，方差不齊采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 MRL／lpr小鼠骨組織結(jié)構(gòu)

緊貼骨軟骨下取一塊組織計(jì)算骨松質(zhì)占骨組織體積比，結(jié)果顯示，狼瘡組小鼠骨小梁占骨組織體積百分比為（21．94±3．01）%，對(duì)照組小鼠為（26．96± 3．14）%，狼瘡組骨小梁較對(duì)照組松散（t＝2．827，P＜0．05）。見(jiàn)圖1。

2．2 兩組小鼠骨TNF-α、NF-κB p50蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，狼瘡組小鼠股骨TNF-α、NF-κB p50蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，定量分析顯示同樣結(jié)果。見(jiàn)圖2和圖3。

2．3 BMMSCs形態(tài)

兩組小鼠BMMSCs原代培養(yǎng)48 h可見(jiàn)散在貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)96 h時(shí)可見(jiàn)大量放射狀的長(zhǎng)梭形細(xì)胞，符合BMMSCs的形態(tài)特征。兩組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差別。見(jiàn)圖4。

2．4 兩組BMMSCs中TNF-α和NF-κB p50表達(dá)

結(jié)果顯示，狼瘡組小鼠BMMSCs胞質(zhì)、胞核棕色成分明顯多于對(duì)照組小鼠。定量分析結(jié)果顯示，狼瘡組TNF-α和NF-κB p50蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0．05或P＜0．01）。見(jiàn)圖5和圖6。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，狼瘡組小鼠骨小梁排列紊亂，骨皮質(zhì)減少，存在骨質(zhì)疏松，與Sun等［5］實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；免疫組化結(jié)果進(jìn)一步顯示狼瘡組小鼠股骨TNF-α及NF-κB p50表達(dá)高于對(duì)照組。但從原位的骨組化，尚不能清楚地區(qū)分在組成骨的多種細(xì)胞中，包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），具體是哪一種細(xì)胞的蛋白表達(dá)減弱。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分離小鼠的BMMSCs，免疫組化染色結(jié)果顯示，狼瘡組TNF-α、NF-κB p50蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，間接提示狼瘡組小鼠BMMSCs NF-κB信號(hào)通路處于較為活化的狀態(tài)，可能與其處于高TNF-α的炎癥環(huán)境有關(guān)。

成骨細(xì)胞來(lái)源于BMMSCs。有研究表明，TNF-α可促進(jìn)BMMSCs成骨分化［6］；也有研究表明，TNF-α可抑制BMMSCs成骨分化［7－9］。前者主要通過(guò)NF-κB或者M(jìn)APK信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)［6］。NF-κB信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)參與代謝尤其是骨代謝的一條重要的信號(hào)通路，NF-κB p50是該信號(hào)通路的重要分子；細(xì)胞外的信號(hào)分子通過(guò)作用于細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體，引起細(xì)胞一系列的分子變化，進(jìn)而引起NF-κB p50轉(zhuǎn)位入核，誘導(dǎo)BMMSCs與成骨相關(guān)基因的表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)也提示SLE患者骨質(zhì)疏松的形成可能是由于BMMSCs向成骨細(xì)胞分化時(shí)，致炎因子改變了信號(hào)通路的活性所致。

總之，本研究提示狼瘡鼠存在骨質(zhì)疏松，其骨及BMMSCs NF-κB信號(hào)通路活化，骨TNF-α增高，為進(jìn)一步闡釋SLE致骨質(zhì)疏松的機(jī)制提供了依據(jù)，也為臨床上對(duì)SLE患者的靶向治療提供了參考。限于本實(shí)驗(yàn)的研究條件，未能檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路上其他分子表達(dá)量的變化，其他致炎因子對(duì)通路的影響，以及該信號(hào)通路與其他信號(hào)通路的相互作用。因此，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)揭示狼瘡鼠BMMSCs活化的NF-κB與骨質(zhì)疏松的因果關(guān)系。

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Expression of TNF-α／NF-κB signaling pathway in the bone of system ic lupus erythematosusm ice（MRL／lpr）

CUITing1，SONG Dong-ming1，QIU Ying-ying1，RUIJin-bing1，WU Ling1，F(xiàn)EIXiao-ming2，LIJing1，TANG Yu1
（1．Department of Rheumatology and Immunology，2．DepartmentofHematology，the Affiliated Hospitalof Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To investigate the tumor necrosis factor-α（TNF-α）／nuclear factor-κB p50（NF-κB p50）signaling pathway in bone of systemic lupus erythematosus mice（MRL／lpr）．M ethods：Six C3He／HeJmice（control group）and six MRL／lprmice（lupus group）were feed，thenmouse femur tissue sectionswere prepared and bone circumstances were observed by hematoxylin-eosin（HE）staining．The proteins of TNF-αand NF-κB p50 were detected by immunohistochemical staining．Bonemarrowmesenchymal stem cells（BMMSCs）were isolated by density gradient centrifugation adherence screeningmethod and cultured，then the expressions of TNF-α，NF-κB p50 were detected by immunocytochemistry staining．Results：Trabecular bone of MRL／lpr lupusmice showed osteoporosis and the percentage of the cortex to the volume of bone of MRL／lprmice were significantly lower compared to control group（P＜0．05）．The protein expression levels of TNF-αand NF-κB p50 on the femur of MRL／lprmice were higher than the C3He／HeJmice（P＜0．05 or P＜0．01）．Immunocytochemistry results displayed that on the BMMSCs of the MRL／lprmice，the protein expression levels of TNF-αand NF-κB p50 were also higher than the C3He／HeJmice（P＜0．05 or P＜0．01）．Conclusion：TNF-α／NF-κB signaling pathway on the bone of lupusmice has been abnormally activated．

systemic lupus erythematosus；mesenchymal stem cells；TNF-α／NF-κB signaling pathway

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81202358）；鎮(zhèn)江市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（SH2013028）；鎮(zhèn)江市學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目

崔婷（1987—），女，碩士研究生；湯郁（通訊作者），副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：cattlemouse＠sohu．com

R593．24

A

1671－7783（2014）05－0380－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140212

2014－07－23 ［編輯］ 劉星星