李小戰(zhàn)，馬紅，許輝，李淑，李遇梅

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

人臍帶間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)方法的改良

李小戰(zhàn)，馬紅，許輝，李淑，李遇梅

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

目的：探討體外組織塊培養(yǎng)原代人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）的改良方法，并觀察其形態(tài)，免疫表型，成脂成骨分化等生物學(xué)特性。方法：從健康足月兒獲得臍帶，將血管剝離后，余下的結(jié)締組織剪成小塊，分別用傳統(tǒng)植塊法和改良植塊法分離培養(yǎng)原代hUC-MSCs。MTT法檢測細胞增殖情況并繪制細胞生長曲線，流式細胞儀檢測細胞免疫表型，成脂成骨誘導(dǎo)分化檢測其分化潛能，化學(xué)染色鑒定誘導(dǎo)分化結(jié)果。結(jié)果：改良植塊法臍帶組織貼壁培養(yǎng)3～4 d即可從組織塊邊緣長出長梭形成纖維樣原代細胞，5～6 d后細胞可長滿80%，比傳統(tǒng)植塊法原代細胞培養(yǎng)周期縮短了一半以上時間，細胞傳代后流水狀或漩渦狀生長，MTT法顯示細胞增殖能力強，流式細胞儀檢測提示CD90，CD105，CD73，CD166，CD29，CD44均陽性表達，陽性率均在95%以上，CD45和HLA-DR均陰性表達，陽性率低于2%；誘導(dǎo)分化實驗及化學(xué)染色結(jié)果證實，該細胞具有成脂和成骨多向分化潛能。結(jié)論：應(yīng)用與酶消化法相結(jié)合的改良植塊法可以獲得hUC-MSCs，比傳統(tǒng)植塊法縮短了原代培養(yǎng)周期，提高了細胞培養(yǎng)效率，所獲得細胞貼壁生長，增殖能力強，表達間充質(zhì)干細胞相關(guān)免疫表型，具有多向分化潛能，可在科研和臨床應(yīng)用中作為種子細胞來源。

臍帶間充質(zhì)干細胞；原代培養(yǎng)；誘導(dǎo)分化

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）是中胚層來源的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞［1－2］，可在體外培養(yǎng)擴增，并能在特定條件下分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞等［3－4］。自從Friedenstein等［5］從骨髓中發(fā)現(xiàn)MSC以來，研究人員目前已從全身多種組織如臍帶、臍血、脂肪、肌肉等中分離獲得MSC［6－7］，其中臍帶來源的間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）因比骨髓取材容易等優(yōu)點近幾年來被廣泛研究［8］。傳統(tǒng)的植塊法原代培養(yǎng)是直接將臍帶組織塊貼壁培養(yǎng)，缺點是培養(yǎng)時間較長［9］，分離效率低，且長時間的培養(yǎng)容易造成霉菌污染，無法滿足臨床或科研的需要。本實驗對傳統(tǒng)植塊法進行改良，用Ⅰ型膠原酶、中性蛋白酶兩種酶聯(lián)合消化后再用植塊法分離培養(yǎng)hUC-MSCs，并觀察其生物學(xué)特性如細胞生長及增殖能力、細胞免疫表型、細胞成脂成骨分化潛能。

1 材料與方法

1．1 材料

臍帶標本取自江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科足月剖宮產(chǎn)健康產(chǎn)婦（均知情同意），標本6 h以內(nèi)處理。所有產(chǎn)婦無系統(tǒng)性疾病且健康狀況良好，術(shù)前簽署知情同意書并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過。

1．2 試劑與儀器

細胞培養(yǎng)基DMEM／F12（1∶1）（美國Hyclone公司），胎牛血清（美國Gibco公司），T25培養(yǎng)瓶，6孔板（美國Corning公司），胰蛋白酶（Gibco公司），Ⅰ型膠原酶（美國Sigma公司），中性蛋白酶（美國Sigma公司），青霉素、鏈霉素（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司），維生素C、β-甘油磷酸鈉、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤（IBMX）、地塞米松、吲哚美辛、胰島素（美國Sigma公司），油紅O（上海邁坤化工有限公司），茜素紅S（南京寧試化學(xué)有限公司），抗人抗體CD90-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE、CD105-PE、CD45-PE，CD44-FITC、CD29-FITC、CD73-FITC以及陰性對照IgG1-PE，IgG2a-FITC（美國eBioscience公司），流式細胞儀（美國BD公司），酶聯(lián)免疫檢測儀（澳大利亞Clinibio公司）。

1．3 方法

1．3．1 hUC-MSCs分離與原代培養(yǎng)

1．3．1．1 傳統(tǒng)植塊法 人臍帶在手術(shù)臺獲取后無菌條件下浸沒于含1%雙抗（青鏈霉素）的DMEM／F12（1∶1）培養(yǎng)基中，玻璃容器密封無菌運送至實驗室。在超凈工作臺內(nèi)取出，用0．9%生理鹽水涮洗2次，去除兩端有瘀血的部分，用含1%雙抗的PBS緩沖液充分沖洗臍帶外周以及臍靜脈內(nèi)腔，剔除動靜脈血管，取臍帶基質(zhì)，剪成4～5 mm3大小的組織塊，分別接種于含有1 mL DMEM／F12培養(yǎng)基（含10%FBS）的T25培養(yǎng)瓶中，每瓶放5塊，共放置10瓶，置于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后首次換液，以后每2～3 d更換培養(yǎng)基，細胞長出至80%融合時去除組織塊，0．25%胰蛋白酶（含0．02%EDTA）消化傳代培養(yǎng)，同時細胞計數(shù)，計算原代培養(yǎng)獲得的細胞數(shù)目。

1．3．1．2 改良植塊法 取臍帶結(jié)締組織剪成4～5 mm3大小的組織塊，預(yù)先加入0．1%的Ⅰ型膠原酶和0．1%中性蛋白酶，于37℃孵育消化1 h，加入等量體積的DMEM／F12培養(yǎng)基停止消化；1 000 r／min離心10 min，棄上清過濾后，留下組織塊，接種于含有1 mL DMEM／F12培養(yǎng)基（含10%FBS）的T25培養(yǎng)瓶中，每瓶放5塊，共放置10瓶，置于37℃、5%的CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2 d后首次換液，以后每2～3 d換液，細胞長出至80%融合后去除組織塊，胰酶消化傳代，同時細胞計數(shù)，計算原代培養(yǎng)獲得的細胞數(shù)目。

1．3．2 hUC-MSCs傳代培養(yǎng) 使用0．25%胰蛋白酶消化后顯微鏡下觀察到細胞變圓以及部分細胞脫落時，棄胰酶并加完全培養(yǎng)基終止消化，吹打底部收集脫落細胞于離心管中，800 r／min離心5 min，棄上清，重復(fù)洗滌2遍，細胞沉淀用DMEM／F12培養(yǎng)基（含10%FBS）重懸后接種于T25細胞培養(yǎng)瓶中，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2 d后觀察到細胞貼壁后換液，以后每2～3 d換液1次。

1．3．3 細胞增殖及生長曲線的繪制 改良植塊法獲得的細胞使用MTT法，對P3，P5，P8代細胞用DMEM／F12培養(yǎng)基（含10%FBS）調(diào)整細胞密度為1×104個／mL，接種于8個96孔板，每板設(shè)3個復(fù)孔，每孔200μL；另設(shè)3孔對照，加200μL PBS。接種后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，連續(xù)8 d每天固定時間取出一塊板，每孔加入MTT溶液（濃度5 mg／mL）20μL，培養(yǎng)箱孵育4 h后棄上清，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），搖床振蕩10 min，用酶標儀以490 nm波長檢測各孔光密度（D）值，代表細胞的相對數(shù)量，繪制其隨時間而變化的生長曲線。

1．3．4 細胞免疫表型檢測 改良法獲得的第3代hUC-MSCs經(jīng)胰蛋白酶消化后調(diào)整細胞密度為105／mL的單細胞懸液，分別加入抗人抗體CD90-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE、CD105-PE、CD45-PE，CD44-FITC、CD29-FITC、CD73-FITC以及陰性對照IgG1-PE，IgG2a-FITC，4°避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞表面抗原。

1．3．5 成脂誘導(dǎo)分化 改良法獲得的第3代hUCMSCs以l×105／mL的密度接種于6孔板中，使用DMEM／F12培養(yǎng)基（含10%FBS）培養(yǎng)細胞，至貼壁生長達80%融合時，選其中3孔為成脂誘導(dǎo)組，換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含高糖DMEM，10%FBS，100 mg／L 1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤，1μmol／L地塞米松，50μmol／L吲哚美辛，10μmol／L胰島素，100 U／mL青霉素和100 mg／L鏈霉素）。另3孔為對照組，仍使用DMEM／F12培養(yǎng)基。誘導(dǎo)期間每隔2～3 d換液1次，鏡下觀察細胞形態(tài)變化及脂滴形成情況。第14天后油紅染色鑒定脂滴的生成。

1．3．6 成骨誘導(dǎo)分化 改良法獲得的第3代hUCMSCs以l×105／mL的密度接種于6孔板中，3孔為成骨誘導(dǎo)組，3孔為對照組。使用DMEM／F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞生長達80%融合時，成骨誘導(dǎo)組改用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含高糖DMEM，10%FBS，1．0μmol／L地塞米松，200μmol／L抗壞血酸，10μmol／Lβ-磷酸甘油，100 U／mL青霉素和100 mg／L鏈霉素）。對照組繼續(xù)使用DMEM／F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。每隔2～3 d換液1次，培養(yǎng)14 d后用茜素紅S染色鑒定鈣結(jié)節(jié)的生成。

1．4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 hUC-MSCs的原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)

傳統(tǒng)植塊法培養(yǎng)約11～12 d可見成纖維樣原代細胞長出，部分形成小的集落，細胞呈紡錘形貼壁生長，15～16 d后細胞即長滿80%（圖1）。改良植塊法培養(yǎng)約3～4 d左右可見長梭形的成纖維樣細胞從組織塊邊緣游離出來，細胞在組織塊厚的地方分布密集，組織塊薄的地方分布稀疏，約5～6 d后細胞達到80%融合（圖1），胰酶消化傳代培養(yǎng)，細胞呈長梭形流水狀生長（圖2）。不同分離方法原代培養(yǎng)hUC-MSCs的效率比較見表1，從該表中可看出，改良法細胞從組織中游離出的時間以及達到80%細胞融合的時間比傳統(tǒng)法明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），但在獲得的原代細胞數(shù)上，兩者無明顯差異（P＞0．05）。

2．2 細胞生長曲線

改良法獲得的P3，P5，P8代hUC-MSCs生長曲線顯示，細胞接種后0～2天處于潛伏期，第3天進入對數(shù)增長期，維持至第6天；之后進入平臺期，顯示出很強的增殖能力（圖3），不同代數(shù)hUC-MSCs的增殖無明顯差異。

2．3 細胞免疫表型

改良法第3代hUC-MSCs經(jīng)流式細胞儀檢測，結(jié)果顯示，干細胞標志物CD90，間質(zhì)標志物CD 105，CD73，黏附分子CD29，CD166，CD44均陽性表達，陽性率均在95%以上；白細胞標志物CD45、主要組織相容性抗原HLA-DR均陰性表達，陽性率不高于2%（圖4）。

2．4 細胞成脂成骨誘導(dǎo)分化

成脂誘導(dǎo)7 d后，誘導(dǎo)組細胞由長梭形變?yōu)闄E圓形或圓形，光鏡下可見部分細胞胞質(zhì)內(nèi)有透亮的脂滴形成，之后脂滴數(shù)目逐漸增加，第14天油紅染色可見脂滴被染成鮮紅色；對照組光鏡下未見脂滴形成，油紅染色亦未見鮮紅色脂滴（圖5）。成骨誘導(dǎo)5～6 d后，誘導(dǎo)組可見細胞形態(tài)由長梭形變?yōu)槎嘟切危?周后行茜素紅染色，可見紅色礦化的鈣結(jié)節(jié)形成；對照組染色無紅色礦化的鈣結(jié)節(jié)形成（圖5）。

3 討論

近年來，hUC-MSCs以其原始性強，來源豐富，低免疫原性［10］，相對純凈污染少，多向分化潛能［2－4］等諸優(yōu)點受到了越來越多的關(guān)注。目前，hUC-MSCs主要是從臍帶結(jié)締組織獲取，但不同實驗室有不同的分離和培養(yǎng)方法［11］，主要有酶消化法和組織塊貼壁法。酶消化法是利用膠原酶或胰蛋白酶將臍帶中的膠質(zhì)降解，從而使細胞分離出來。酶消化法可在短時間內(nèi)獲得臍帶原代細胞，但操作步驟復(fù)雜，極易對細胞產(chǎn)生化學(xué)污染和機械損傷，并且酶的濃度及消化時間不好掌握，且使用的膠原酶價格昂貴，因此不適合規(guī)?；a(chǎn)。

傳統(tǒng)組織塊貼壁法主要利用臍帶組織中hUCMSCs對塑料培養(yǎng)瓶較強的黏附能力，將其在組織塊貼壁培養(yǎng)過程中逐步遷移出來，而組織塊中內(nèi)皮細胞及造血系細胞等不貼壁，可以在換液過程中被逐漸棄去。該方法步驟簡單，減少了細胞機械損傷和化學(xué)污染的概率，能更好地保持細胞的活力，同時省去了酶的使用，減少了經(jīng)濟成本，也適合規(guī)?；a(chǎn)，因此傳統(tǒng)植塊法比酶消化法有更多的優(yōu)點。但是傳統(tǒng)植塊法的缺點是培養(yǎng)時間較長，從植塊到傳代約需要14～20 d不等［9］，分離效率低，很難在短時間內(nèi)獲得大量hUC-MSCs。

臍帶結(jié)締組織中富含各種膠原蛋白以及層黏連蛋白，本實驗預(yù)先使用Ⅰ型膠原酶消化膠原蛋白，中性蛋白酶降解層黏連蛋白，降低了臍帶華通氏膠的黏稠性，使組織塊更容易貼壁，更有利于hUC-MSCs從組織塊長出。實驗結(jié)果證明，改良植塊法貼壁3～4 d即可長出原代細胞，5～6 d后長滿80%即可傳代，比傳統(tǒng)的單純植塊法縮短了一半以上的時間，獲得的細胞呈長梭形或紡錘形，傳代后細胞呈旋渦狀或流水狀生長。

到目前為止，hUC-MSCs沒有可以作為鑒別標準的特異性細胞抗原標志［12］。我們檢測了部分細胞免疫表型：干細胞標志物CD90，間質(zhì)標志物CD 105，CD73，黏附分子CD29，CD166，CD44均陽性表達，陽性率均在95%以上，血細胞及內(nèi)皮細胞相關(guān)標志物CD45、主要組織相容性抗原HLA-DR均陰性表達，陽性率低于2%；同時結(jié)合細胞貼壁生長的特性，成骨成脂誘導(dǎo)分化證實其具有多向分化的潛能。以上這些生物學(xué)特性符合國際細胞治療協(xié)會制定的最低間充質(zhì)干細胞標準［13］，因此我們認為分離得到的是非血細胞非內(nèi)皮細胞的hUC-MSCs。

目前，hUC-MSCs因眾多優(yōu)點成為最具有應(yīng)用潛能的種子細胞之一，本實驗結(jié)合了酶消化法的優(yōu)點，改良了組織塊貼壁法，建立了一種高效的hUCMSCs原代分離培養(yǎng)方法，這些結(jié)果為其在科研和臨床中應(yīng)用提供了依據(jù)。

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Im proved primary cultivation of human umbilical cord mesenchymal stem cells

LIXiao-zhan，MAHong，XU Hui，LIShu，LIYu-mei
（Department of Dermatology，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To improve the tissuemass primary culture protocol of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells（hUC-MSCs），so as to explore theirmorphology，cell surfacemarkers，osteogenic and adipogenic differentiation potential and observe biological properties．M ethods：Human umbilical cordswere obtained from healthy full-term delivered newborns．After stripping off blood vessels，the remaining connective tissueswere cut into small fragments，and primary hUC-MSCs were separated by culture of traditional and improved tissue explants methods．The hUC-MSCs were tested with MTT method and the growth curves of them were drawn．Cell surfacemarkerswere detected by flow cytometry．After osteogenic and adipogenic differentiation，the potentiality of their differentiation was detected by chemistry staining．Results：After 3－4 days of incubation，flat or spindle-shaped fibroblast-like primary cellswere presented，and cells reached 80%confluence after 5－6 days of incubation．Culture period was shortened by more than half．Flowing water-like or spiral growth morphology was presented after cell passage．MTT revealed high capability of proliferation．Flow cytometry analysis showed CD90（＋），CD105（＋），CD73（＋），CD166（＋），CD44（＋），CD29（＋），positive rate of95%ormore；CD45（－），HLA-DR（－），negative rate of notmore than 2%．Its differentiation potential was proved by osteogenic and adipogenic differentiation，which was proved by chemistry staining．Conclusion：An improved primary culture method of hUCMSCs has been developed．Primary cells can be obtained from improved tissue explantsmethod combined enzyme digestion technique．Primary cell culture time was shortened，and the efficiency of cell culture wasimproved．Cells isolated by the new method from the human umbilical cords had the following biological characteristics：adherent growth，high proliferation，mesenchymal stem cell phenotype，and multipotent differentiation．They could be used as the source of seed cells in scientific research and clinical applications．

hUC-MSCs；primary cultivation；induced differentiation

R329．2

A

1671－7783（2014）05－0375－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y140204

國家自然科學(xué)基金資助項目（30972663）

李小戰(zhàn)（1980—），男，碩士研究生；李遇梅（通訊作者），副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：l．yumei＠aliyun．com

2014－06－14 ［編輯］ 陳海林