鄧文騫 王璐 李雪 袁瓊嘉

成都體育學院（成都610041）

腦血管?。╟erebrovascular disease，CVD）占我國乃至全世界最常見致死和成人殘疾原因的第二位［1，2］。其中腦梗死最常見，它由腦血管阻塞性缺血所致，發(fā)病率為110/10 萬人口， 約占全部腦血管病的60%～80%［3］。如何有效預防腦梗死以及減少血管阻塞后腦梗死的面積，成為預防醫(yī)學和臨床醫(yī)學的研究熱點。

腦缺血預處理 （neuronal ischemic preconditioning，NIPC） 是特異性地對大腦進行一種或多種低于永久性損害的刺激， 從而引發(fā)機體內(nèi)在的神經(jīng)保護措施， 對于隨后更為嚴重的腦缺血損傷具有保護作用［4］。 運動預處理作為一種特殊形式的缺血缺氧預處理， 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用及機制研究尚屬起步階段。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，運動預處理減少大鼠大腦皮質(zhì)及海馬細胞凋亡， 對力竭運動導致的腦細胞凋亡有一定的保護作用［5，6］。 然而，運動預處理對更嚴重的腦缺血梗死是否也有保護作用及其相關機 制 尚 不 明 了。 低 氧 誘 導 因 子-1α （hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α） 是一種重要的轉錄因子，因其可誘導血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）、促紅細胞生成素（EPO）及一氧化氮合酶（iNOS）等靶基因的轉錄而成為機體缺血缺氧應答時穩(wěn)定細胞內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)中心。 本實驗采用大鼠腦中動脈阻塞性缺血（MCAO）模型，觀察運動預處理對局灶性腦缺血再灌注誘導的大鼠腦梗死體積的影響， 并探討其相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物及其分組

4 月齡成年雄性SPF 級SD 大鼠60 只， 體重（325±30）克，購自四川大學華西醫(yī)學中心實驗動物中心，生產(chǎn)許可證編號：SCXK（川）2009-09；使用許可 證 編 號：SYXK （川）2009-045， 動 物 批 號：20111001。 大鼠隨機分為缺血再灌注組 （IR 組，n =24）、假手術組（sham 組，n = 12）和運動預處理組（EP組，n = 24）。

1.2 實驗方法

IR 組參照改良的Longa［7］大腦中動脈二次線栓法制作腦中動脈缺血再灌注模型。 以10%水合氯醛0.3 ml/kg 腹腔麻醉，頸正中切口，行右側腦中動脈缺血（MCAO）手術：暴露頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）及頸內(nèi)動脈（ICA），將0.26 mm 單絲尼龍魚線頭端0.5 cm 用石蠟包被， 并于20 mm 長處標記，結扎ECA 遠端，用提拉線暫時阻斷CCA 及ICA 血流，在結扎線近端距分叉5 mm 處剪一約0.3 mm 小口，全部大鼠均通過右側CCA 切口處插入，經(jīng)分叉部進入ICA，栓線長度自CCA 分叉處約18～20 mm，根據(jù)動物體重而定，栓塞右側大腦中動脈（MCA），然后縫合皮膚，栓線尾端部分固定于皮膚上。 缺血達2 h 后小心抽出栓線，即形成再灌注。在缺血期間及再灌注后2 h 保持體溫在（37±0.5）℃。動物蘇醒后觀察其體態(tài)及行為， 以大鼠手術麻醉清醒后出現(xiàn)左側肢體癱瘓、站立不穩(wěn)、提尾時向一側轉圈為MCAO 模型成功的判斷標準。

sham 組行假手術代替缺血再灌注。 不插入尼龍魚線，其余操作步驟同缺血再灌注組。

EP 組前3 天進行無負重適應性游泳，10 min/d，從第4 天開始進行不負重中等負荷游泳訓練，60 min/d，6 d/w，持續(xù)4 周；游泳玻璃缸體積為150 cm×60 cm×100 cm，水深> 70 cm，水溫（34±2）℃，室溫25℃。 大鼠運動后迅速用毛巾擦干皮毛并保暖。 末次運動后24 小時制作缺血再灌注模型，方法同IR 組。

運動造模實驗在成都體育學院國家體育總局四川省運動醫(yī)學重點實驗室完成，MCAO 造模、組織病理學實驗、 熒光定量PCR 及Western blot 實驗均在四川大學生物治療國家重點實驗室醫(yī)學遺傳實驗室完成。

1.3 取材

所有大鼠于MCAO 手術后24 h 采用股動脈放血處死， 剪開皮膚暴露頭及頸段， 從頸椎處剪斷頸髓，分離去除后頸部肌肉，用彎鉗仔細剔除顱骨，避免硬腦膜劃傷腦組織， 隨后從延髓開始慢慢分離顱底組織取下腦。 各組大鼠腦組織隨機分為3 小組（sham 組各小組n = 4，IR 組各小組n = 8、EP 組各小組n = 8），有一小組進行TTC 染色計算梗死體積，另一小組進行病理學檢測， 最后一小組進行熒光定量RT-PCR 及Western blot 實驗， 分別行-20℃冷凍保存、4%中性多聚甲醛固定和液氮保存。

1.4 TTC 染色

將放入-20℃冰箱中的腦組織速凍20 分鐘，隨后取出切片，每個腦組織切成5 片，每間隔2 mm 切一片，第一刀在腦前極與視交叉連線中點處；第二刀在視交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間。切片后將組織置于2%TTC 溶液中，用錫箔紙蓋住，放入37℃溫箱25 min，每隔5 分鐘翻動腦片，使其均勻接觸到染色液。然后用10%甲醛溶液固定，過夜，采用病理圖像分析儀測量腦梗死面積，根據(jù)梯形法則計算腦梗死體積［8］。

1.5 免疫組化染色

取出多聚甲醛固定標本， 常規(guī)石蠟包埋并制成5 mm 切片，每個腦標本取3 張切片，脫蠟至水，梯度酒精脫水，3%H2O2及正常血清處理后， 加入抗鼠HIF-1α 單克隆抗體 （美國Santa Cruz 公司），4℃過夜后，依次滴加山羊抗鼠二抗IgG（美國Cell Signal公司）及SP（工作濃度1∶200），37℃各孵育60 min，DAB 顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。 以PBS 代替一抗作為空白對照。 采用計算機圖像采集分析系統(tǒng) （美國Nikon & SPO， 軟件為Version3.0）采集圖像，采用Image Pro-Plus 圖像分析軟件定量分析蛋白表達。 分析每張切片隨機選取10個高倍視野的圖像，各組所選部位相同。

1.6 熒光定量RT-PCR 檢測

取部分液氮保存腦組織，按50～100 mg/mlTrizol劑量加入Trizol 提取總RNA。 采用紫外分光光度計測定RNA 含量、 純度； 采用TaKaRa Prime ScriptTMReagent Kit（大連寶生物）逆轉錄試劑盒進行逆轉錄得 到cDNA； 采 用TaKaRa SYBR Premix Dimer EraserTM（大連寶生物）進行Real-time PCR。 引物序列：HIF -1α （ 擴 增 長 度 234 bp） 上 游：5′ -CGGCGGCGAGAACGAGAAGAAAAAG-3′， 下游：5′-TTCTCACACGTAAATAACTGATGGT -3′ ；β -actin（擴增長度99 bp）上游：5′-CGT AAA GAC CTC TAT GCC AAC A-3′，下游：5′-TAG GAG CCA GGG CAG TAA TC-3′。 反應結束后，分析PCR 產(chǎn)物融解曲線，確定反應的特異性，并根據(jù)各樣本Ct 值進行數(shù)據(jù)處理。 根據(jù)RT-PCR 儀給出各反應孔的Ct 值， 以βactin 基因為內(nèi)參， 按照公式ΔΔCt =（待測樣品目的基因平均Ct 值-待測樣品管家基因平均Ct 值）-（基準樣品目的基因平均Ct 值-基準樣品管家基因平均Ct 值）計算出ΔΔCt 值，各組樣本HIF-1α 基因的相對表達水平=2-ΔΔCt。

1.7 Western blot 檢測

從液氮中取出腦組織， 標本放入預冷研缽充分短時研磨，按500 μl/100mg 標準加入蛋白裂解液至研缽沖洗研磨好的組織，充分混勻后將懸液放入EP管中，蛋白裂解液購自北京百泰克生物試劑公司，使用前加蛋白酶抑制劑：PMSF［174 mg/10ml（異丙醇）］1%；Leupeptin（1 mg/ml）1/500；Pepstatin A（5 mg/ml）1/1000。 將懸液放在冰上冰浴20 min， 確保裂解充分，隨后14000 r/min、4℃離心20 min，收集上清，即大鼠腦組織總蛋白。 采用BCA 蛋白定量試劑盒（購自武漢博士德生物工程有限公司） 定量檢測各標本總蛋白。 各標本取20 μg 總蛋白加入上樣緩沖液后于熱板上煮10 分鐘，隨后進行SDS-PAGE 電泳，電泳后轉至PVDF 膜，X 線膠片曝光進行免疫印記信號檢測。 Western-blot 所用抗體同免疫組化實驗抗體。 電泳結果采用Quantity One 圖像分析軟件進行定量分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0 進行統(tǒng)計學分析。 實驗結果均以“均數(shù)±標準差” 表示， 組間差異采用t 檢驗兩兩比較，P < 0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TTC 染色結果

TTC 染色后，正常腦組織呈磚紅色，而缺血梗死區(qū)為蒼白色，與正常組織邊界清晰，顯示出明顯的梗死區(qū)域。IR 組大鼠腦組織梗死體積較大；EP 組大鼠腦梗死體積較IR 組明顯縮小，有顯著性差異（P <0.05）；sham 組未見梗死灶形成（見表1，圖1）。

表1 各組大鼠MCAO 腦梗死體積比較

圖1 各組大鼠MCAO 大腦TTC 染色結果

2.2 HIF-1α 免疫組化結果

sham 組偶見HIF-1α 表達，但因表達量少，無法進行圖像數(shù)據(jù)分析。 IR 組和EP 組均可見較多的HIF-1α 陽性表達細胞，光鏡下胞核呈黃褐色，也有部分為胞漿陽性，在腦組織大部分區(qū)域有表達，圖像分析顯示EP 組HIF-1α 表達強于IR 組， 差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01，見表2，圖2）。

圖2 各組大鼠腦組織HIF-1α 免疫組化結果（×200，×400）

表2 各組大鼠腦組織免疫組化檢測HIF-1α 表達結果

2.3 HIF-1α 熒光定量RT-PCR 檢測結果

各組標本HIF-1α 及β-actin 擴增融解曲線均只有一個峰，表明引物特異性好，無引物二聚體和非特異性擴增發(fā)生。表3 結果顯示，IR 組和EP 組HIF-1α 基因表達水平較sham 組均明顯升高（P < 0.05），而EP 組HIF-1α 基因表達水平高于IR 組， 差異具有顯著性（P < 0.05）。

表3 各組大鼠腦組織熒光定量RT-PCR 檢測HIF-1α 表達結果

2.4 HIF-1α 蛋白Western blot 檢測結果

從圖3 可以看出，IR 組和EP 組大鼠腦組織HIF-1α 蛋白表達水平均較sham 組明顯上調(diào)，EP 組升高幅度大于IR 組。圖像分析軟件測得各條帶灰度值比較見表4。

圖3 各組大鼠腦組織HIF-1α 蛋白Western blot 檢測結果

表4 各組大鼠腦組織HIF-1α 蛋白Western blot 條帶灰度值比較

3 討論

腦梗死是腦血管阻塞造成腦細胞缺血缺氧所致的一類嚴重的腦血管病。 雖然哺乳動物對大腦缺血缺氧高度敏感，但大量研究表明，哺乳動物大腦具有獨特的適應能力，即腦缺血預適應。 非致死性血管阻塞誘導腦產(chǎn)生缺血耐受，在腦嚴重缺血缺氧狀態(tài)下產(chǎn)生強大的神經(jīng)保護作用及其相關機制已有大量報道［9-11］，結果均證實腦缺血預處理對大腦產(chǎn)生了明顯的保護作用。

運動預處理作為一種特殊的腦缺血缺氧預處理形式，對重要器官如心臟、腦產(chǎn)生的影響受到廣泛關注。Ding 等［12］發(fā)現(xiàn)，前期持續(xù)3 周的運動預處理能改善卒中后大鼠腦微血管完整性，這與Kang 等［13］的研究相符。 Curry 等［14］也報道，持續(xù)3 周的跑臺運動抑制了大鼠腦梗后的炎癥反應。 本實驗結果也顯示，4周運動訓練后，大鼠再發(fā)生局灶性腦缺血再灌注，其腦梗死體積較未進行運動預處理的IR 組明顯減小，表明4 周中等負荷游泳運動在一定程度上抵抗嚴重缺血缺氧，對阻塞性腦梗死產(chǎn)生保護作用。

低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是在1992 年由Semenza 等［15］首 先在Hep3B 細胞中發(fā)現(xiàn)的。 HIF-1α 是HIF 的亞單位，其在機體抵抗缺血缺氧方面發(fā)揮重要作用［16］。 研究發(fā)現(xiàn)運動刺激同樣能夠影響HIF-1α 表達，范錦勤等［17］研究發(fā)現(xiàn)單純訓練刺激會引起大鼠腦組織HIF-1α 升高。 徐建方等［18］發(fā)現(xiàn)訓練和低氧均能顯著提高肝組織HIF-1α表達。 本研究中，大腦局灶性缺血2 小時再灌注后，EP 組和IR 組大鼠大腦HIF-1α mRNA 水平和蛋白水平均較sham 組升高，表明急性缺血缺氧激活腦神經(jīng)細胞HIF-1α 基因表達， 使細胞處于一種特殊的代謝狀態(tài)，對抗劇烈的能量缺失刺激。 而EP 組在進行了為期4 周的中等負荷運動后，免疫組化、熒光定量RT-PCR 和Western blot 結果顯示，無論在基因轉錄水平還是在蛋白表達水平， 其HIF-1α 均明顯高于未進行預處理的IR 組， 表明運動作為一種特殊的、輕微的腦缺氧缺血刺激，促進了HIF-1α 表達，調(diào)動機體的自我保護機制， 使腦細胞產(chǎn)生了一定的缺氧耐受，從而抵抗更嚴重的缺血缺氧刺激。

關于預處理與缺血事件之間的間隔， 有研究發(fā)現(xiàn)， 腦缺血預處理產(chǎn)生快速耐受和延遲耐受兩種作用［19，20］。 本研究采用4 周運動預處理結束后24 小時進行大腦局灶性缺血再灌注， 主要考慮到雖然中等負荷運動造成的大鼠腦缺血缺氧刺激不大， 但持續(xù)時間較長， 很可能造成體內(nèi)尤其是缺血缺氧較明顯的器官細胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)表達發(fā)生變化， 而這些蛋白可能參與到產(chǎn)生延遲耐受保護的過程中。 實驗結果也顯示，運動預處理確實對24 h 后的局灶性腦缺血梗死產(chǎn)生了保護作用。在接下來的研究中，我們將重點考慮運動預處理是否產(chǎn)生快速耐受以及對比兩種耐受保護效果。 此外，由于HIF-1α 基因調(diào)節(jié)的下游因子種類繁多，功能復雜，具體是通過哪些信號通路產(chǎn)生保護作用，仍有待于研究。

4 總結

本研究結果表明，4 周中等負荷運動預處理減少局灶性缺血引起的大鼠大腦梗死體積， 可能通過上調(diào)HIF-1α 表達產(chǎn)生作用。

［1］ Bonita R，Mendis S，Truelsen T，et al. The global stroke initiative. Lancet Neurol，2004，3（7）：391-393.

［2］ 衛(wèi)生部. 中國衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒，2006：45.

［3］ 饒明俐，王志文，黃如訓，等. 中國腦血管病防治指南（試行版）. 衛(wèi)生部疾病控制司、 中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會，2005：30.

［4］ Nandagopal K，Dawson TM，Dawson VL. Critical role for nitric oxide signaling in cardiac and neuronal ischemic preconditioning and tolerance. J Pharmacol Exp Ther，2001，297（2）：474-478.

［5］ 王璐， 袁瓊嘉. 運動預處理對力竭運動誘導的大鼠海馬細胞凋亡的影響. 體育科學，2009，29（3）：52-57.

［6］ 王璐，鄧文騫，袁瓊嘉.運動預處理對力竭運動誘導的大鼠大腦皮質(zhì)細胞凋亡的影響. 中國運動醫(yī)學雜志，2012，31（7）：602-606，622.

［7］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Rebersible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke，1989，20（2）：84-91.

［8］ Yin D，Zhou C，Kusaka I，et al. Inhibition of apoptosis by hyperbaric oxygen in a rat focal cerebral ischemic model. J Cereb Blood Flow Metab，2003，23（2）：855-864.

［9］ Ebrahimi SM，Aboutaleb N，Nobakht M. Consequences of ischemic preconditioning of kidney：Comparing between male and female rats. Iran J Basic Med Sci，2012，15 （6）：1148-1153.

［10］ Fang B，Li XM，Sun XJ，et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption.Int J Mol Sci，2013，14（5）：10343-10354

［11］ Narayanan SV，Dave KR，Perez -Pinzon MA. Ischemic preconditioning and clinical scenarios. Curr Opin Neurol，2013，26（1）：1-7.

［12］ Ding YH，Ding Y，Li J，et al. Exercise pre-conditioning strengthens brain microvascular integrity in a rat stroke model. Neurol Res，2006，28（2）：184-9.

［13］ Kang KA，Seong H，Jin HB，et al. The effect of treadmill exercise on ischemic neuronal injury in the stroke animal model： potentiation of cerebral vascular integrity. J Korean Acad Nurs，2011，41（2）：197-203.

［14］ Curry A，Guo M，Patel R，et al. Exercise pre-conditioning reduces brain inflammation in stroke via tumor necrosis factor-alpha，extracellular signal-regulated kinase 1/2 and matrix metalloproteinase-9 activity. Neurol Res，2010，32（7）：756-762.

［15］ Semenza GL，Wang GL. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation. Mol Cell Biol，1992，12 （12）：5447-5454.

［16］ Gidday JM. Cerebral preconditioning and ischemic tolerance. Nat Rev Neuro Sci，2006，7（6）：437-448.

［17］ 范錦勤，林文弢，翁錫全. 低氧訓練對大鼠腦組織Ngb、HIF-1α、Bax 和Bcl-2 的影響. 體育學刊，2012，19（1）：129-133.

［18］ 徐建方，馮連世，路瑛麗，等. 不同模式低氧耐力訓練對大鼠肝組織HIF-1α、HO-1 mRNA 表達的影響. 中國體育科技，2011，47（1）：126-129，136.

［19］ Lin WY，Chang YC，Lee HT，et al. CREB activation in the rapid, intermediate, and delayed ischemic preconditioning against hypoxic-ischemia in neonatal rat. J Neurochem，2009，108（4）：847-859.

［20］ Zhang J，Yang ZJ，Klaus JA，et al. Delayed tolerance with repetitive transient focal ischemic preconditioning in the mouse. Stroke，2008，39（3）：967-974.