陳華根，劉小花綜述，許穎審校（.四川省成都市新都區(qū)人民醫(yī)院檢驗科 60500；.成都醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，成都 60500）

20世紀90年代世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計資料表明，各種感染性疾病仍然是威脅人類健康的主要殺手，占世界人口死因的32.7%，其中呼吸道感染位居首位［1］。特別是甲型流感病毒基因變異重排，曾引起百年來數(shù)次世界范圍內(nèi)流感爆發(fā)流行，死亡人數(shù)超過2000萬。從1997年香港發(fā)現(xiàn)首例禽流感（H5N1）患者至今，國內(nèi)數(shù)省市有禽流感（H7N9）散發(fā)，死亡人數(shù)已達數(shù)百人［2－3］。2003年因冠狀病毒所致嚴重急性呼吸道綜合征，死亡1千余人［4］。因艾滋病、糖尿病和耐藥等因素影響，國內(nèi)結(jié)核菌感染及肺結(jié)核患者居高不下［5］。不僅造成患者死亡，同時嚴重影響經(jīng)濟發(fā)展。呼吸道病原體的實驗室檢測，可以明確感染病原體，有利于對疾病做出及時診斷、治療，制定防控策略，阻止傳播和流行。呼吸道病原體的實驗室檢測技術(shù)有多種，主要分為病原體分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測。本文通過查閱文獻，將主要檢測技術(shù)及其在呼吸道病原體檢測中的具體應(yīng)用作一概述。

1 病原體分離培養(yǎng)

標本來源為鼻洗液、咽漱液、咽拭子、鼻拭子、痰、血液、穿刺標本和尸檢材料等。以防污染，及時接種較好，或?qū)吮局糜诒鶋貎?nèi)送交實驗室，選定合適的培養(yǎng)基或細胞組織，在2～3 h內(nèi)接種培養(yǎng)。

痰是分離培養(yǎng)應(yīng)用最廣泛的標本，合格的痰標本要求白細胞數(shù)大于25個／低倍視野，鱗狀上皮細胞小于10個／低倍視野，或白細胞／鱗狀上皮細胞大于2.5／1。定量培養(yǎng)菌量大于或等于107cfu／mL 可判定為致病菌［6－7］。細菌培養(yǎng)一般選用血平板、巧克力平板、中國藍／麥康凱培養(yǎng)基。病毒培養(yǎng)常選用猴腎或人胚腎細胞、二倍體細胞株、Hela、HepG2細胞、犬腎傳代細胞和雞胚接種，通過電子顯微鏡、細胞病變效應(yīng)、凝血實驗、凝血抑制實驗、中和實驗和空斑形成實驗進行鑒定。

病原體分離培養(yǎng)是鑒別呼吸道病原體類型的金標準。特別是細菌培養(yǎng)不僅能鑒定病原體，而且可通過藥敏實驗選擇合適的抗菌藥物。病毒培養(yǎng)由于實驗條件要求較高，且操作繁瑣，在普通實驗室應(yīng)用受限，多通過血清學(xué)實驗和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定病毒。

2 血清學(xué)檢測

利用抗原抗體反應(yīng)特異性原理，用已知抗原測定抗體或用已知抗體測定抗原，從而判定感染病原體類型。通常根據(jù)抗原抗體特性，偶聯(lián)不同載體或不同標記物，設(shè)計不同檢測方法。常用檢測方法有如下幾種。

2.1 凝集實驗分為直接凝集實驗和間接凝集實驗。直接凝集實驗無需偶聯(lián)載體，抗原抗體直接發(fā)生肉眼可見的凝集反應(yīng)，如血型鑒定實驗和傷寒桿菌凝集實驗。間接凝集實驗利用紅細胞、明膠顆粒、膠乳及細菌等作為載體，和抗原偶聯(lián)后，與特異性抗體發(fā)生凝集反應(yīng)，常根據(jù)載體名稱命名，例如紅細胞凝集實驗、明膠顆粒凝集實驗、膠乳凝集實驗等。間接凝集實驗應(yīng)用多于直接凝集實驗。

2.2 中和實驗用已知抗體血清和待測病毒懸液混合，室溫下作用一段時間后接種敏感細胞，經(jīng)培養(yǎng)后觀察細胞病變效應(yīng)或紅細胞吸附現(xiàn)象是否消失，即特異性抗體能否中和相應(yīng)病毒的感染性。

2.3 補體結(jié)合實驗補體結(jié)合實驗是一種以免疫溶血系統(tǒng)作為指標，檢測另一反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的傳統(tǒng)方法。具有靈敏度高、實驗條件要求低、操作簡便等優(yōu)點，是一種經(jīng)典的實驗方法。

2.4 固相膜免疫實驗利用硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜和尼龍膜等作為載體，金元素、硒元素和酶促底物置于載體上，抗原和抗體通過穿流或橫流的形式在載體上反應(yīng)，常用的實驗方式有免疫層析實驗、免疫滲濾實驗、酶聯(lián)免疫斑點實驗、免疫印跡法等。呼吸道病原體的抗原或抗體皆可通過此方法檢測，但應(yīng)用并不普遍。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗用已知的抗原（抗體）包被在聚苯乙烯微孔上，和待測的抗體（抗原）、酶標的抗原（抗體）進行反應(yīng)，通過洗滌分離，繼而加入酶促底物顯色，根據(jù)呈色的強弱，判定待測物的有無或多少。該方法是臨床實驗室通過檢測抗原抗體診斷病原體感染應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，絕大多數(shù)呼吸道病原體可用酶聯(lián)免疫吸附試驗進行檢測。

2.6 熒光免疫技術(shù)（熒光抗體技術(shù)）利用熒光素（異硫氰酸熒光素）標記抗體，與載玻片上的抗原（抗體）、待測抗體（抗原）反應(yīng)，洗滌分離后，用熒光顯微鏡觀察有無顯熒光的抗原抗體復(fù)合物存在。測定方式分為直接法和間接法，間接法的敏感度比直接法高5～10倍，故實驗室常采用間接法。該方法是呼吸道病原體，特別是新發(fā)高致病性病原體檢測的常用方法。如甲型流感病毒H1N1、禽流感病毒H5N1、禽流感病毒H7N9、引起嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒的檢測。由于呼吸道病原體多呈混合型感染，一次聯(lián)檢多種病原體的抗原或抗體，對于呼吸道疾病的防治具有重要意義。陳輝蘭［8］、俞小衛(wèi)等［9］報道了用直接免疫熒光法檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒以及副流感病毒1、2、3型等7種呼吸道常見病毒抗原。單詠梅等［10］、艾洪武等［11］、吉祖活等［12］報道了用間接免疫熒光法檢測呼吸道肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團菌、Q熱立克次體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒等9種呼吸道病原體IgM 抗體。

2.7 蛋白芯片技術(shù)將病原體蛋白（抗原或抗體）固定在微陣列上，通過一系列反應(yīng)，利用芯片閱讀儀收集反應(yīng)信號，從而檢測病原體。該方法可以一次檢測多種病原體，有利于快速診治呼吸道感染性疾病。楊侃等［13］報道用蛋白芯片技術(shù)檢測流感病毒、呼吸道合胞病毒、柯薩奇病毒、腺病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體。邢穎等［14］報道用蛋白芯片法檢測肺炎支原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒。

3 分子生物學(xué)技術(shù)

從20世紀50年代Watson和Crik提出DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)至今，分子生物學(xué)領(lǐng)域取得了巨大的成就。完成了生命天書“基因草圖”的繪制，使人們從基因角度明白了生命現(xiàn)象的本質(zhì)和調(diào)控機制。蛋白組學(xué)的研究，豐富和完善了基因組學(xué)，不僅能直接解釋生命活動規(guī)律，還在疾病的診斷和防治中擁有更大的應(yīng)用前景。以雜交技術(shù)和探針技術(shù)為基礎(chǔ)，以Mullis的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)為標志的基因擴增技術(shù)更是層出不窮，極大地豐富和完善了分子生物學(xué)技術(shù)［15］。PCR 基本原理類似DNA 的天然復(fù)制，特異性引物與靶序列互補，通過變性、復(fù)性、延伸多個重復(fù)循環(huán)，從而獲得大量靶序列產(chǎn)物。從早期單一基因擴增檢測單一病原體，發(fā)展到現(xiàn)在的同時多基因檢測多種病原體，滿足了多種病原體混合感染的診斷。對于感染性病原體的診斷，檢測方法主要有如下幾種。

3.1 多重PCR 技術(shù)多重PCR 技術(shù)利用多對引物，同時擴增多種病原體基因。如Mo等［16］檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒和新型甲型流感病毒H1N1。向彩云等［17］檢測肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，肺炎支原體，肺炎衣原體。

3.2 依賴核酸序列的擴增技術(shù)（NASBA）NASBA 從PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來，擴增速率和靈敏度超過PCR 的恒溫擴增技術(shù)。Demian 等［18］報道用于呼吸道合胞病毒兩個血清型的擴增，靈敏度高于間接熒光法和病毒培養(yǎng)。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）LAMP是一種簡單、快速、靈敏的基因擴增技術(shù)，適宜病原體的快速分子生物學(xué)診斷。Ito等［19］用于檢測甲型流感病毒H1N1、甲型流感病毒H3N2、乙型流感病毒。劉毅等［20］用于檢測痰液結(jié)核分枝桿菌。

3.4 靶序列富集多重PCR 技術(shù)一次反應(yīng)中對多種靶序列進行敏感而特異的擴增和檢測，適宜呼吸道病原體混合感染的快速診斷。王鑫磊等［21］報道檢測鮑曼不動桿菌等14種病原體。

3.5 基因芯片技術(shù)將多種靶序列基因固定在載體上，與標記的樣本核酸雜交，雜交信號經(jīng)芯片閱讀儀處理而得出檢測結(jié)果，可一次快速檢測多種呼吸道病原體［21－22］。

綜上所述，病原體的檢測方法層出不窮，為臨床醫(yī)生準確、快速診斷提供了有效途徑，并且隨著醫(yī)學(xué)知識與技術(shù)的不斷發(fā)展，病原體的檢測方法也將隨之發(fā)展。在臨床工作中結(jié)合實際，采用最適宜的檢測方法可為結(jié)果的準確、快速提供必要的保證。

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