富校軼，高永欣，張佰榮，孫茂成，王舒然*

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院食品質(zhì)量與安全教研室，吉林 吉林 132013;2. 吉林化工學(xué)院化工與生物技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132022)

·綜 述·

大豆肽的制備、提取與結(jié)構(gòu)鑒定研究進展

Progress on preparation，extraction and structure identification of soybean peptides

富校軼1，高永欣1，張佰榮2，孫茂成1，王舒然1*

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院食品質(zhì)量與安全教研室，吉林 吉林 132013;2. 吉林化工學(xué)院化工與生物技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132022)

大豆肽是大豆蛋白質(zhì)經(jīng)過蛋白酶水解、微生物發(fā)酵后分離、提取獲得的具有多種生物功能的低分子肽類。近年來，研究發(fā)現(xiàn)大豆肽具有易消化和低抗原性的特點，具有調(diào)節(jié)免疫、降膽固醇、抗疲勞、抗氧化等多種生物活性，因此，大豆肽成為食品領(lǐng)域研究和開發(fā)的熱點。本文對大豆肽的制備、提取方法以及結(jié)構(gòu)鑒定進行簡要概述。

大豆肽；制備；提??；結(jié)構(gòu)鑒定

近年來，肽類物質(zhì)尤其是大豆肽由于具有特殊的營養(yǎng)和功能引起了國內(nèi)外廣泛的關(guān)注。大豆肽是由大豆蛋白經(jīng)過蛋白酶作用或者微生物技術(shù)處理后，再經(jīng)過分離、精制等特殊處理而得到的低聚肽混合物，還包括一些游離氨基酸、水、灰分和少量的糖分等。大豆肽一般是由3～6個氨基酸組成的低分子量肽，蛋白質(zhì)含量為85%左右，氨基酸組成與大豆蛋白質(zhì)大體相同，必需氨基酸含量豐富且平衡。大豆肽的平均分子量小于1 000，主要出峰位置在分子量為300～700[1]。大豆肽具有良好的生物活性，如：促進脂肪代謝、抗氧化、降血脂和抗血栓形成等；同時具有良好的營養(yǎng)特征和加工性能，大豆肽能促進微生物的生長發(fā)育和代謝，在醋、醬油、奶酪、發(fā)酵食品中添加大豆肽可以顯著提高產(chǎn)品的品質(zhì)和營養(yǎng)價值，并增強產(chǎn)品的口感風(fēng)味，提高產(chǎn)品的生產(chǎn)效率等，此外，大豆肽還能用于生產(chǎn)酶制劑[2]。

大豆肽的生產(chǎn)制備已經(jīng)成為大豆蛋白深加工的一個重要方向，國際上也有大型公司在生產(chǎn)大豆肽制品，我國目前大量的院校、企業(yè)、研究所開展了對大豆肽的研究，應(yīng)用前景良好。

1 大豆肽的制備

目前大豆肽的制備方法主要有三種：化學(xué)水解法、酶水解法和微生物發(fā)酵法。不同的方法有各自的優(yōu)缺點，最終得到的大豆肽的功能特性、純度以及理化性質(zhì)會有所不同，所以根據(jù)實際需要選擇不同的制備方法尤為重要[3]。

1.1 化學(xué)水解法

化學(xué)水解法有兩種：酸水解法和堿水解法，我們一般稱為酸堿水解法。即采用酸、堿等化學(xué)試劑在一定溫度下促使蛋白質(zhì)分子肽鏈發(fā)生斷裂，并形成小分子多肽物質(zhì)。酸堿水解法較簡單，并且生產(chǎn)成本低，但是存在一些缺點，比如水解沒有特異性、工藝難控制、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、氨基酸容易發(fā)生破壞、營養(yǎng)成分損失大和影響環(huán)境等。因此，化學(xué)水解法大多用在實驗室的研究中，不適合于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)[4]。

1.2 酶水解法

酶水解法是利用蛋白酶在適宜的pH和溫度下進行大豆蛋白酶解反應(yīng)，把大分子蛋白質(zhì)降解為小分子肽。這種酶解法生產(chǎn)的大豆肽產(chǎn)品安全性高、蛋白質(zhì)利用率高、易于被人體吸收利用、好控制，比化學(xué)水解法更具優(yōu)勢。

在酶解大豆蛋白的過程中，正確的選擇蛋白酶是關(guān)鍵。如今蛋白酶的種類非常多，按水解方式一般分為如下幾種：內(nèi)切酶、外切酶和一些能夠水解蛋白質(zhì)酯鍵和酰胺鍵的酶。內(nèi)切酶作用于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵(-CO-NH-)，將蛋白質(zhì)水解成多肽，常見的內(nèi)切酶有動物蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等；外切酶是作用于蛋白質(zhì)或多肽分子氨基末端或羧基末端的肽鍵，而獲得游離的氨基酸，外切酶非常重要的應(yīng)用就是把肽鏈末端的疏水性氨基酸水解掉，降低多肽的苦味；水解酯鍵和酰胺鍵的蛋白酶作用位點隨肽鍵種類而異，如胰蛋白酶的切點是羧基側(cè)為堿性氨基酸的肽鍵，胃蛋白酶的切點是兩端有芳香族氨基酸的肽鍵[5]。

陳潔等[6]研究了木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶在不同溫度、pH值、水解時間、酶濃度下水解大豆豆渣的最適酶解反應(yīng)條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：木瓜蛋白酶的最適水解條件是底物質(zhì)量分數(shù)5%、酶濃度20 000 U/g，水解溫度為50 ℃，pH 7，水解6 h，最大水解度可達87.31%；堿性蛋白酶的最適水解條件是底物質(zhì)量分數(shù)5%、酶濃度20 000 U/g，水解溫度為55 ℃，pH 9，水解3 h，最大水解度可達91.23%；中性蛋白酶的最適水解條件是底物質(zhì)量分數(shù)5%、酶濃度15 000 U/g，水解溫度為45 ℃，pH 7，水解8 h，最大水解度可達81.42%。Lee Jin Yeol 研究了不同預(yù)處理方法(熱處理、酸處理)對大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物水解度、氨基氮、氮溶指數(shù)、肽鏈長度的影響[7]。Chiang Wen Dee等采用酶的膜反應(yīng)器能夠連續(xù)生產(chǎn)大豆肽，由于及時分離了酶解生成的多肽，有效消除了產(chǎn)物的干擾，因而提高了酶解效率[8]。并且采用氧化穩(wěn)定指數(shù)(OSI)檢測發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白及其水解物的抗氧化活性顯著提高。

1.3 微生物發(fā)酵法

目前大豆活性肽的微生物發(fā)酵法被認為是最有效、最先進的方法。微生物代謝活動產(chǎn)生的混合酶能夠催化生物活性肽的生成，同時微生物可借助多肽水解液提高生長及產(chǎn)酶能力，具有一定的協(xié)同作用，生產(chǎn)效率更高。該法生產(chǎn)的大豆肽不是簡單地將大豆蛋白質(zhì)切成小肽，而是將釋放的小肽通過移接和重排，經(jīng)過微生物作用對某些苦味基團進行修飾、轉(zhuǎn)移和重組，使獲得的大豆肽具有更好的溶解性，無苦味，增強其應(yīng)用價值。目前應(yīng)用較廣的微生物主要有枯草芽孢桿菌、放線菌、乳酸菌、黑曲霉3350和保加利亞乳桿菌等。微生物發(fā)酵法制備大豆肽具有原料成本低廉、工藝過程簡單、條件溫和、發(fā)酵效率高、產(chǎn)品品質(zhì)好等特點[3]。

錢森和等[9]通過單因素試驗以及Box-Benhnken組合的響應(yīng)面方法，建立了KH菌種組合3個影響因素與響應(yīng)值(大豆肽含量)相互作用的數(shù)學(xué)模型。得到最優(yōu)發(fā)酵條件接種量為27.95%，枯草芽孢桿菌與黑曲霉接種比例為2∶1，發(fā)酵溫度為35.92 ℃，含水量為52.71%，發(fā)酵時間為48 h；在此優(yōu)化條件下發(fā)酵豆粕實際產(chǎn)出大豆肽含量為8.73%，提高了6.02倍。

楊彩艷在高轉(zhuǎn)化率條件下，通過測定枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉和他們的混合菌種對大豆肽轉(zhuǎn)化率的影響中，發(fā)現(xiàn)用混合菌種發(fā)酵制備低分子量肽優(yōu)于單菌種發(fā)酵[10]。

2 大豆肽的精制提取

2.1 超 濾

超濾(Ultrafiltration,UF)是一種利用膜的“篩分”作用進行膜分離的過程，即在一定的壓力(一般為0.1～0.5 MPa)作用下，當(dāng)含有大、小分子物質(zhì)兩類溶質(zhì)的溶液流過被支撐的膜表面時，溶劑和小分子溶質(zhì)將透過膜作為透過物被收集起來；大分子溶質(zhì)則被膜截留而作為濃縮液被回收[12]。超濾技術(shù)具有耗用化學(xué)試劑少、工藝流程簡單的優(yōu)點，是一種較實用的技術(shù)手段。目前，國內(nèi)外已經(jīng)廣泛應(yīng)用超濾技術(shù)來分離純化大豆肽，提高了大豆肽的品質(zhì)。實際操作中超濾膜由于濃差極化、膜孔堵塞等問題會導(dǎo)致生產(chǎn)率降低，所以正確掌握操作條件和參數(shù)很重要。

孫月梅[11]研究發(fā)現(xiàn)，采用2 000 Da的超濾膜，超濾的最適條件是壓力0.37 MPa、pH 6、溫度44 ℃、時間100 min。在此超濾條件下的響應(yīng)面分析預(yù)測值為29.099 12 L/(m2·h)。大豆肽的抗氧化作用得到了顯著提高。采用超濾膜對大豆肽進行處理，能有效提高大豆肽中抗氧化活性成分的含量。Patrycja Puchalska等人利用超濾技術(shù)分離大豆肽，通過不同的截留分子量的膜過濾，能夠分離出5 000～10 000、3 000～5 000、3 000以下等不同分子量的大豆肽，并進一步對他們進行抗氧化活性的測定[12]。陳山采用超濾技術(shù)處理大豆肽發(fā)酵產(chǎn)物，實驗結(jié)果表明：超濾處理可以在不添加任何化學(xué)試劑的情況下直接從發(fā)酵產(chǎn)物中分離提純出大豆肽純化物[13]。發(fā)酵液的濃度對膜通量有影響，濃度越大，膜通量就越小，但如果以單位時間單位面積超濾膜所處理的大豆肽固形物含量來評價膜效能，較高的濃度更能發(fā)揮超濾膜的效能。由于超濾膜對大豆肽的選擇性較好，超濾法在用于大豆肽分離提純的同時，也可以作為一種檢測手段用來分析發(fā)酵產(chǎn)物中組分的相對分子量分布，為評價大豆蛋白的酶解效率提供了一種簡單、快捷的測定方法。

2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)是采用顆粒十分細的高效固定相并結(jié)合高壓泵輸送流動相的原理，樣品組分流過固定相時，在兩相中進行連續(xù)反復(fù)多次分配，形成差速移動，從而達到有效分離樣品的方法[14]。在活性肽的分離純化中，反向高效液相色譜(RP-HPLC)通常作為最后一個純化步驟使用，鐘芳等人利用RP-HPLC對經(jīng)DA201-C、Sephadex G-15分離純化后的大豆ACE抑制活性肽進行進一步的分離純化，以5%乙腈(含0.05%TFA)為A液，80%乙腈(含0.05%TFA)為B液，優(yōu)化的洗脫條件為：0～10 min 0～20%B；10～30 min 20%～40%B；30～35 min 40%～100%B；35～38 min 100%～0B；38～45 min 100%A，并運用了分析型RP-HPLC再次純化最高活性組分至單一峰，得到純化大豆肽[15]。

2.3 正交軸逆流色譜法

正交軸逆流色譜( Cross-axis Counter Current Chromatography,Cross-axis CCC) 主要用于中等分子量(分子量>3 000)大豆肽的分離。與傳統(tǒng)的高速逆流色譜的區(qū)別在于其螺旋管支撐件的自轉(zhuǎn)軸與儀器公轉(zhuǎn)軸是相互垂直的，在進行行星式運動時形成三維的不對稱離心力場，這一特殊結(jié)構(gòu)使其非常有利于親水性溶劑系統(tǒng)固定相的保留，從而適用于大分子的生物樣品的分離制備。正交軸逆流色譜在利用親水性溶劑系統(tǒng)分離大極性化合物和雙水相系統(tǒng)分離水溶性生物大分子等方面的應(yīng)用具有明顯的優(yōu)勢，正交軸逆流色譜已經(jīng)成功地用在多種蛋白質(zhì)、生物酶和多糖等大分子化合物的分離中[16]。逆流色譜是一種不用固態(tài)載體的液液分配層析法，它具有分離純度高、樣品回收率高、對樣品無沾染吸附、溶劑用量少、適應(yīng)性強、能兼作小量分析和制備提純等優(yōu)點。

魏蕓[17]等發(fā)現(xiàn)：分別以12.5%PEG8000-25%磷酸氫二鉀(質(zhì)量比1∶1)的溶劑系統(tǒng)，以及正丁醇∶三氟乙酸∶水(120∶1∶160，V/ V)的溶劑系統(tǒng)，用下相作流動相，上相作固定相，采用500 r/min的轉(zhuǎn)速和1 mL/min流動相流速對標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及大豆肽進行分離。在分離度損失不大的基礎(chǔ)上提高了進樣量，證明了正交軸逆流色譜法用于制備的有效性。

2.4 凝膠過濾法

凝膠過濾色譜(Gel Filtration Chromatography)作為目前最廣泛使用的肽分離方法之一，其特點是分離條件溫和、樣品回收率高、實驗重復(fù)性高、操作時間短、設(shè)備簡便經(jīng)濟等，也是所有色譜技術(shù)中最簡單、條件最溫和的方法，且完全是基于樣品的分子量大小來進行分離的。

利用凝膠過濾法提取分離經(jīng)過酶解的大豆肽溶液，過SephdexG-25凝膠層析柱(1.0 cm×80 cm)。用大豆肽溶液洗脫，控制流速在220 nm處測定吸光度，收集色譜圖中峰洗脫液，冷凍干燥，即得到大豆肽各組分，從而進行下一步的鑒定[18]。

3 大豆肽的結(jié)構(gòu)鑒定

大豆肽的結(jié)構(gòu)鑒定可以采用氨基酸分析儀法、DNA轉(zhuǎn)錄法和質(zhì)譜法等。

氨基酸分析儀對樣品的純度要求非常高，難度大，比如氮端有封口，或者肽鏈中存在改性氨基酸和疏水性很強的肽段均會使測定中斷或者產(chǎn)生錯誤，所以一般認為此種方法只是在少量的測定步驟內(nèi)才有效[19]。DNA轉(zhuǎn)錄法首先要得到與被測肽段對應(yīng)的基因片段，通過分析該基因片段的堿基序列，然后再將它轉(zhuǎn)譯為對應(yīng)的氨基酸序列段，這種方法顯然適合大分子長鏈的蛋白質(zhì)，對于短的肽鏈效果并不好。質(zhì)譜法作為一種蛋白質(zhì)、肽鏈和氨基酸檢測的手段，是目前最有效的方法，同時是國內(nèi)外研究最熱的技術(shù)。質(zhì)譜法用于蛋白質(zhì)和多肽的測序是近年來非常具有開創(chuàng)性的進展之一，作為一個新的研究領(lǐng)域，質(zhì)譜可以作為將各種蛋白質(zhì)與序列數(shù)據(jù)庫聯(lián)系起來的橋梁，成為鑒定蛋白質(zhì)及多肽的首選方法，質(zhì)譜具有快速性、高敏感性等許多優(yōu)點，尤其適合多肽物質(zhì)的鑒定。生物質(zhì)譜根據(jù)質(zhì)量數(shù)和所載電荷數(shù)不同的多肽片段在磁場中產(chǎn)生不同軌道而以質(zhì)核比(M/Z)的方式來分離它們。1980年以來發(fā)展起來的電噴霧電離技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸-離子化-飛行時間質(zhì)譜使質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析上的應(yīng)用發(fā)生了革命性的飛躍[20]。

電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)是近幾年迅速發(fā)展并逐步完善起來的一種電離質(zhì)譜，特別適用于極性大、熱不穩(wěn)定的天然化合物的分析，它已經(jīng)成功應(yīng)用于多種類型的質(zhì)量分析中。因其具有高特異性、高靈敏度以及多級質(zhì)譜等技術(shù)特點，故可以直接進行混合物的微量分析。電噴霧離子化質(zhì)譜可產(chǎn)生多價離子化的蛋白或多肽，允許相對分子質(zhì)量達100 000的蛋白質(zhì)進行分析，分辨率在 1 500～2 000 amu，精確度能達到0.01%。

連續(xù)流快原子轟擊質(zhì)譜(cf-FAB)是近幾年發(fā)展起來的新方法。cf-FAB是一種弱離子化技術(shù)，可將肽類或小分子蛋白離子化成MH+或MH-形式，主要應(yīng)用于肽類的分離檢測，具有中等分辨率。

基質(zhì)輔助激光解吸-離子化-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/MS) 是目前蛋白質(zhì)鑒定中精確測定分子質(zhì)量的手段之一，特別適合對混合蛋白和多肽類物質(zhì)的相對分子質(zhì)量的測定，其靈敏度和分辨率較高。它同時結(jié)合液相色譜的聯(lián)用技術(shù)可以高效率地鑒定多肽物質(zhì)，適合分析絕大多數(shù)蛋白質(zhì)，特別適合分析多肽類和大分子蛋白質(zhì)的混合物。

核磁共振(NMR) 由于圖譜信號的純數(shù)字化、過度的重疊，范圍過寬(由于相對分子質(zhì)量太大)，核信號弱等原因，所以在蛋白和多肽物質(zhì)的分析中應(yīng)用不多。隨著二維、三維以及四維 NMR 的應(yīng)用，以及分子生物學(xué)、計算機處理技術(shù)的發(fā)展，使NMR逐漸成為此類物質(zhì)分析的主要方法之一。

有些情況，單一的分離、檢測方法不能滿足要求，因此研究時會結(jié)合實際情況，將不同的分離方法聯(lián)合起來使用，并利用不同的結(jié)構(gòu)鑒定方法，如鐘芳等人運用RP-HPLC制備和純化后得到的大豆ACE抑制活性肽，最后通過LC-MS液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定出其組分的序列結(jié)構(gòu)，經(jīng)過LC-MS序列分析，降血壓組分9-I的分子質(zhì)量為772. 4，有三種可能的結(jié)構(gòu)：VISTGAEP、VLSTGAEP和ANSAGTVGP。Kim Soo Yong 等人將酶解蛋白魚骨物過SP-Sephadex C-25，再過 Sephadex G-25柱然后采用RP-HPLC 進行純化，得到了抗氧化活性最強的肽段。還依次采用離子交換柱將鱈魚酶解物進行分離，篩選出抗氧化活性較高的肽段，并利用制備型和分析型RP-HPLC進行分離純化，最后用Q-TOF ESI質(zhì)譜測定出抗氧化活性最高的肽的氨基酸序列為 Glu-Ser-Thr-Val-Pro-Glu-Arg-Thr-His-Pro-Ala-Cys-Pro-Asp-Phe-Asn[21]。

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1673-2995(2014)01-0051-04

富校軼(1971-)，女(漢族)，高級工程師,碩士.

王舒然(1968-)，男(漢族)，教授，博士.

TS255.1

A

2013-12-16)