蘆方茹，馬 云，徐永杰，雷 玲，宋新強(qiáng)

(信陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院/動(dòng)物遺傳實(shí)驗(yàn)室，河南 信陽(yáng) 464000)

學(xué)科動(dòng)態(tài)

基于雙向電泳技術(shù)的家畜蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

蘆方茹，馬 云*，徐永杰，雷 玲，宋新強(qiáng)

(信陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院/動(dòng)物遺傳實(shí)驗(yàn)室，河南 信陽(yáng) 464000)

隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成與落幕，各種家畜如小鼠、牛、豬等的測(cè)序工作也相繼完成，動(dòng)物基因組學(xué)的研究重點(diǎn)已轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)。而蛋白質(zhì)組學(xué)是功能基因組學(xué)中非常重要的一部分，作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中經(jīng)典技術(shù)的雙向電泳技術(shù)就顯得尤為重要，論文對(duì)雙向電泳在牛、豬等家畜中的基礎(chǔ)研究進(jìn)展予以綜述，并就蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的前景加以小結(jié)和展望。

雙向電泳技術(shù)；家畜；蛋白質(zhì)組學(xué)；研究進(jìn)展

隨著技術(shù)的革新與發(fā)展，生命科學(xué)領(lǐng)域也得到了前所未有的變化，全基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、RNA組學(xué)等概念應(yīng)運(yùn)而生。蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)是指一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，其本質(zhì)是大規(guī)模水平研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的特征。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)主要包括：質(zhì)譜分析，X-射線(xiàn)晶體衍射，核磁共振和凝膠電泳。而雙向電泳是一種等電聚焦電泳與SDS-PAGE相結(jié)合、分辨率更高的蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)技術(shù)。第一向根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(pI)的不同，用等電聚焦電泳分離蛋白質(zhì)；第二向利用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠)按蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的大小對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。該方法可在膠片上分離出成千上萬(wàn)種蛋白質(zhì)多肽，適用于組織與細(xì)胞中大規(guī)模的蛋白質(zhì)分離，對(duì)于研究蛋白的理化性質(zhì)如等電點(diǎn)和分子量、蛋白的分離純化、蛋白表達(dá)差異的查找、質(zhì)譜相結(jié)合的手段進(jìn)行特定蛋白的鑒定等都非常有效，因而是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的經(jīng)典技術(shù)手段。近幾年來(lái)，蛋白質(zhì)雙向電泳在家畜蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)揮有非常重要的作用，本文主要就該技術(shù)在牛、豬等家畜中的應(yīng)用研究做一綜述。

1 基于雙向電泳技術(shù)的牛蛋白質(zhì)組學(xué)

牛的產(chǎn)肉和產(chǎn)乳性狀一直是人們關(guān)注的重點(diǎn)，隨著生活條件的改善，牛肉和牛奶的需求日益增加，如何找到提高其產(chǎn)量的內(nèi)在機(jī)制已成為亟待解決的問(wèn)題。牛蛋白質(zhì)組學(xué)研究為闡明牛的乳質(zhì)、肉質(zhì)、妊娠、疾病等提取了較好的研究策略，它有利于人們弄清某種特定蛋白質(zhì)對(duì)于生命活動(dòng)的功能。

1.1 牛乳質(zhì)性狀相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

Idoia等[1]以健康奶牛和乳腺炎奶牛的血清和乳清為材料，采用雙向電泳耦合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常的和乳腺炎乳清中含有不同的成分，如乳運(yùn)鐵蛋白，就只能在發(fā)炎的動(dòng)物樣本中檢測(cè)到。Chevalier等[2]通過(guò)使用蛋白質(zhì)雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)分離蛋白斑點(diǎn)，觀(guān)察二向電泳試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)少數(shù)高豐度的蛋白質(zhì)，酪蛋白(αS1-αS2-，β-，κ-，和γ-)，β-乳球蛋白，α-乳清蛋白，血清白蛋白，占原料奶樣品蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的絕大多數(shù)。同時(shí)，當(dāng)脫脂乳混合物90 ℃加熱10 min后，天然乳清蛋白水平降低而二硫鍵連接的復(fù)合物增加。該研究不僅揭示了眾多二硫鍵介導(dǎo)的相互作用，還可用于分析牛奶的還原/氧化和處理后乳制品蛋白質(zhì)的存儲(chǔ)。另外，Holland等[3]在非還原性條件下以牛奶為試驗(yàn)材料進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳，從試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)κ-CSN(κ-酪蛋白)為復(fù)雜的單體模式和二硫鍵連接的低聚物，對(duì)應(yīng)六聚物單體的斑點(diǎn)參與不同糖型和磷酸化低聚物的形成，并觀(guān)察到了牛奶中κ-csn的天然分布，對(duì)二硫鍵的作用進(jìn)行了討論。Ramona等[4]以商業(yè)巴氏消毒和商業(yè)的超高溫(UHT)牛奶為試驗(yàn)材料進(jìn)行SDS-PAGE試驗(yàn)，然后進(jìn)一步通過(guò)雙向電泳分離牛乳肽，第一向使用ph3-10的膠條，第二向?yàn)?2%T凝膠。分析試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)UHT牛奶中的蛋白質(zhì)和肽的數(shù)量減少。

Vanderghem等[5]使用蛋白質(zhì)雙向電泳和基質(zhì)輔助激光解吸/電離串聯(lián)飛行時(shí)間技術(shù)分離鑒定牛奶中的乳脂肪球膜蛋白質(zhì)組。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩性離子洗滌劑可以從膜材料中高效回收整合蛋白和外周蛋白；確認(rèn)了牛奶脂肪球膜中最豐富的蛋白質(zhì)，并鑒定了牛奶脂肪球膜中的微量蛋白質(zhì)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)組的完成。牛麗莉等[6]為了分析產(chǎn)前一周和產(chǎn)后一周奶牛血漿蛋白之間的差異表達(dá)，采用了雙向電泳技術(shù)，包括熱SDS法，pH4-7的膠條(17 cm)和梯度凝膠等。共檢測(cè)出239個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，其中有12個(gè)點(diǎn)在牛血漿蛋白豐度出現(xiàn)超過(guò)3倍的變化，其中之一經(jīng)MADIL-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定為結(jié)合珠蛋白，其在產(chǎn)后一周的奶牛血漿中表達(dá)增加。該研究發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)后奶牛的生理變化。

1.2 牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

Seo等[7]采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法考察與韓國(guó)褐牛經(jīng)濟(jì)表現(xiàn)相關(guān)的遺傳標(biāo)記，使用雙向電泳技術(shù)分析取自屠宰場(chǎng)的肉類(lèi)樣品的背最長(zhǎng)肌，依據(jù)大理石花紋得分評(píng)價(jià)確定了四個(gè)候選點(diǎn)：205，84，204和198，這項(xiàng)研究證實(shí)了褐牛經(jīng)濟(jì)性狀育種值和點(diǎn)強(qiáng)度之間的關(guān)系。姜昊[8]采用熒光雙向電泳結(jié)合生物質(zhì)譜的技術(shù)，以中國(guó)草原紅牛和長(zhǎng)白山黑牛眼肌為研究對(duì)象，尋找在眼肌中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)被鑒定的差異表達(dá)蛋白可能在脂肪沉積中起到關(guān)鍵性作用，為探索牛肉質(zhì)性狀中脂肪沉積和代謝的分子生物學(xué)機(jī)制及肉牛的育種改良提供依據(jù)。

1.3 牛妊娠時(shí)期的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

Kim等[9]為了分析、分離牛胎盤(pán)蛋白質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行雙向電泳試驗(yàn)，等電點(diǎn)范圍選擇在4.0～7.0和6.0～9.0。試驗(yàn)結(jié)果約檢測(cè)到2000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。MALDI-TOF MS分析后鑒別出273個(gè)蛋白質(zhì)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了牛妊娠后期胎盤(pán)復(fù)合蛋白質(zhì)組的關(guān)鍵蛋白，此蛋白質(zhì)組可能揭示胎盤(pán)的功能并協(xié)助蛋白質(zhì)功能分析。Rong等[10]為了找出牛早期妊娠特有的乳清蛋白，對(duì)五頭懷孕(30和50 d)和五頭非懷孕荷斯坦奶牛的奶樣進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其中有12個(gè)點(diǎn)發(fā)生差異表達(dá)，6點(diǎn)顯著上調(diào)，四點(diǎn)下調(diào)，兩個(gè)點(diǎn)被確定為懷孕特有的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)被鑒定為NA-DH脫氫酶亞基2，乳鐵蛋白，白蛋白，血清白蛋白前體和鐵傳遞蛋白。這些蛋白將來(lái)可能被應(yīng)用于牛早期妊娠的檢測(cè)。

1.4 牛疾病感染前后的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

Boehmer等[11]為了研究未感染大腸桿菌奶牛和感染大腸桿菌18 h后奶牛的蛋白質(zhì)組變化，采用蛋白質(zhì)雙向電泳和基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定牛奶中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)和進(jìn)行肽測(cè)序。該研究為大腸菌群乳腺炎的蛋白調(diào)制和這種疾病鑒定過(guò)程中的生物標(biāo)志物提供了一定的依據(jù)。邊艷杰等[12]為了研究感染結(jié)核病牛的牛奶蛋白質(zhì)組，以類(lèi)結(jié)核病牛的奶樣為試驗(yàn)材料進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳試驗(yàn)。通過(guò)該試驗(yàn)研究更加敏銳的特定的診斷類(lèi)結(jié)核病的生物標(biāo)志物。定量分析結(jié)果顯示主要差異在pH4.5區(qū)域，相對(duì)于對(duì)照組酪蛋白存在于被感染組。

1.5 牛精液蛋白質(zhì)組學(xué)研究

Lee等[13]以韓牛精液為材料進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳試驗(yàn)用以研究精液蛋白質(zhì)組。第一向使用18cm，ph3-11的膠條；第二向使用12%的丙烯酰胺凝膠；在經(jīng)過(guò)MALDI-TOF MS分析和NCBInr搜索。結(jié)果有20個(gè)蛋白質(zhì)斑通過(guò)NCBInr搜索進(jìn)行了肽測(cè)序，這些蛋白可能用于為影響雄性韓牛生育能力和提高精液受精能力的蛋白質(zhì)。

2 基于雙向電泳技術(shù)的豬蛋白質(zhì)組學(xué)

2.1 豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

徐永杰等[14]通過(guò)對(duì)比各種不同試驗(yàn)方法條件的效果優(yōu)化了豬肌肉蛋白質(zhì)雙向電泳的主要條件，分析了試驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題。該試驗(yàn)以梅山母豬為試驗(yàn)材料進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳試驗(yàn)，建立了豬骨骼肌組織2-DE及其圖譜，為進(jìn)一步開(kāi)展豬肌肉相關(guān)蛋白質(zhì)組的研究奠定了基礎(chǔ)。

2.2 豬疾病治療相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

Lu[15]為了研究菌素誘導(dǎo)的糖尿病小豬和未誘導(dǎo)小豬的冠狀動(dòng)脈支架內(nèi)(ISR)再狹窄組織的蛋白質(zhì)變化，對(duì)糖尿病和非糖尿病小豬重要的ISR和非ISR段的內(nèi)膜組織進(jìn)行雙向電泳和MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論是糖尿病還是非糖尿病小型豬其AFABP水平在ISR組織比非ISR組織顯著增加，且糖尿病ISR的AFABP水平比非糖尿病ISR組織的在的高?？偨Y(jié)發(fā)現(xiàn)增加人類(lèi)動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的AFABP表達(dá)與分泌AFABP，通過(guò)活性氧介導(dǎo)的激活作用，促進(jìn)動(dòng)脈平滑肌的生長(zhǎng)和遷移。王新潔等[16]建立了豬肝臟蛋白質(zhì)組雙向電泳體系，分別對(duì)5種不同的豬肝臟樣品進(jìn)行雙向電泳試驗(yàn)并進(jìn)行了優(yōu)化，得到了具有統(tǒng)計(jì)意義和量分析意義的蛋白點(diǎn)，可用于鑒別不同的豬肝臟樣品，且為肝病的診斷、分期、治療提供了有效依據(jù)。

2.3 豬免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

Wence等[17]為了研究給早期斷奶豬補(bǔ)充精氨酸可提高機(jī)體的免疫狀態(tài)和蛋白質(zhì)的合成的機(jī)制，將12只21 d的體重相同的健康仔豬隨機(jī)分成兩組，測(cè)試組的仔豬飼養(yǎng)的飼料中添加L-精氨酸的濃度為6.0 g/kg，而項(xiàng)控制組分別飼喂補(bǔ)充L-丙氨酸的濃度為12.3 g/kg(等氮項(xiàng)控制)。7 d后，收集空腸黏膜進(jìn)行2-D PAGE MS試驗(yàn)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)精氨酸調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成、中間代謝和組織增長(zhǎng)，降低了蛋白質(zhì)水平。

2.4 豬其它方面的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

Vidal和Cabezas-Cerrato[18]對(duì)豬和牛的晶狀體進(jìn)行研究，經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)雙向電泳試驗(yàn)后，19個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)中有14個(gè)可以重合。這么高的相似度說(shuō)明了豬和牛的晶狀體可能通過(guò)相同的方式進(jìn)行晶狀體的翻譯后修飾。胡惠忠等[19]為了解卵母細(xì)胞的成熟機(jī)制，對(duì)未成熟和成熟后的豬卵母細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳分析，然后對(duì)比分析所得到的兩個(gè)圖譜觀(guān)察到差異點(diǎn)共有35個(gè)，在成熟卵母細(xì)胞中有22個(gè)表達(dá)量上調(diào)，13個(gè)表達(dá)量下調(diào)。該試驗(yàn)優(yōu)化了豬卵母細(xì)胞的雙向電泳條件，并初步討論的卵母成熟過(guò)程中蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。

3 基于雙向電泳技術(shù)的其他家畜蛋白質(zhì)組學(xué)研究

3.1 羊的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

Kiel等[20]為了開(kāi)發(fā)抗蠕蟲(chóng)動(dòng)物疫苗，對(duì)經(jīng)IgG(免疫球蛋白G)免疫檢測(cè)所確定的被蛇形毛圓線(xiàn)蟲(chóng)感染的羊進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，使用雙向電泳技術(shù)對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，及以抗被蛇形毛圓線(xiàn)蟲(chóng)羊血漿為探針進(jìn)行Western blot，最后用質(zhì)譜分析法確定免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。結(jié)果共識(shí)別28個(gè)免疫指標(biāo)，為了解宿主-寄生蟲(chóng)相互作用的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。Pisanu等[21]使用蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜分析的技術(shù)對(duì)羊奶脂肪球蛋白(MFGPS)進(jìn)行了研究，通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜從61個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的圖譜中確定了29個(gè)羊奶脂肪球蛋白，并對(duì)脫脂乳和乳清進(jìn)行2-DE/MS，得到了所有主要羊奶蛋白質(zhì)圖譜及其定位。該試驗(yàn)獲得了第一個(gè)羊MFGPs2-DE圖譜，為不同的生理和病理?xiàng)l件下的表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ)。徐鐵山等[22]為了研究卵泡蛋白，以綿羊卵泡液為試驗(yàn)材料，對(duì)比不同樣品制備的方法，構(gòu)建綿羊卵泡蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜，并與血漿蛋白2-DE圖譜對(duì)比分析。最終發(fā)現(xiàn)熱的SDS法直接裂解法處理樣品得到的圖譜效果更好；其蛋白質(zhì)成分與血漿蛋白質(zhì)組大致相似，證明了卵泡液是血漿組分跨過(guò)血一卵泡屏障轉(zhuǎn)移的產(chǎn)物這一結(jié)論。

3.2 狗的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

Palviainen[23]收集了四只被蝰蛇咬傷的狗的尿液，對(duì)尿樣進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)圖像分析，發(fā)現(xiàn)毒蛇咬傷試樣組和對(duì)照組相比試樣組蛋白質(zhì)點(diǎn)的容積是平均值的1.5倍，在蝰蛇咬傷狗尿液中有7個(gè)蛋白顯著(P<0.05)過(guò)度表達(dá)，其中有5個(gè)已被鑒定。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了蝰蛇咬傷改變了狗的蛋白質(zhì)組。

3.3 兔子的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

Jielile等[24]將42只兔子隨機(jī)分為對(duì)照組，固定組，早期運(yùn)動(dòng)組，術(shù)后石膏固定組和早期運(yùn)動(dòng)治療組，取跟腱樣品顯微觀(guān)察并進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳分離蛋白質(zhì)，首先用軟件確認(rèn)差異蛋白，然后通過(guò)使用肽質(zhì)量指紋圖譜，串聯(lián)質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒別。這些差異表達(dá)的蛋白可能通過(guò)生物學(xué)力學(xué)機(jī)制有助于斷裂跟腱的愈合。

隨著蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)的日益成熟，越來(lái)越多的科研人員將蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)應(yīng)用于各種家畜，研究高產(chǎn)性狀，也以各家畜為試驗(yàn)對(duì)象研究各種疾病的生物標(biāo)志物，各種代謝途徑的機(jī)制等，并取得了一定的研究成果，為人類(lèi)帶來(lái)了福音。

4 小結(jié)與展望

蛋白質(zhì)組的研究不僅為生命活動(dòng)規(guī)律提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，也為眾多種疾病機(jī)理的闡明及攻克提供理論根據(jù)和解決途徑。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)研究不僅是探索生命奧秘的必須工具，也能為人類(lèi)健康事業(yè)帶來(lái)巨大的利益。而蛋白質(zhì)雙向電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)主要技術(shù)手段，為科研人員從分子生物學(xué)方面研究生物提供了許多便利，雖然有些試驗(yàn)沒(méi)有達(dá)到預(yù)期結(jié)果，但不斷有科研人員對(duì)各種試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化并從事新的研究，相信不久的將來(lái)蛋白質(zhì)雙向電泳可以得到更廣泛的應(yīng)用，在蛋白質(zhì)組學(xué)方面取得更重大的成果。

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ProgressofDomesticAnimalProteomicsBasedonTwo-dimensionalElectrophoresis

LU Fang-ru，MA Yun*，XU Yong-jie，F(xiàn)U Wei-wei,LEI Ling，SONG Xin-qiang

(AnimalGeneticLaboratory,CollegeofScience,XinyangNormalUniversity,XinyangHenan464000)

With the completion of Human Genome Project,a variety of animals,including mice,bovine,pigs and etc,also complete the sequencing.Functional genomics is becoming the focus in animal Genomics research.And proteomes is part of functional genomics.So as the classical technology of proteomes,two-dimensional electrophoresis technology is particularly important.The progress of proteomics about bovine,pig and other domestic animals which based on Two-dimensional electrophoresis was simply discussed in this paper.And proteomics technology was summarized and the prospect of it was also discussed in the end.

two-dimensional electrophoresis; domestic animals; proteomics;progress

2013-05-31，

2013-06-27

國(guó)家自然科學(xué)基金(31172193)；河南省杰出青年基金項(xiàng)目(134100510012)；河南省高?？萍紕?chuàng)新人才計(jì)劃項(xiàng)目(2012HASTIT027)；河南省教育廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2011A180027)

蘆方茹(1990-)，女，河南許昌人，本科，研究方向：生物科學(xué)。

*[通訊作者]馬 云(1974-)，男，寧夏平羅人，博士，副教授，研究方向：生物技術(shù)與動(dòng)物遺傳育種。E-mail:mayun_666@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)01-0001-04