喬海生，蔡其剛，馬利青

（青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧810016）

剛地弓形蟲（Toxoplasmagondii）可專性寄生于人和動物的除紅細(xì)胞以外的有核細(xì)胞內(nèi)，是一種重要機會致病性原蟲，能夠引起人和動物弓形蟲?。═oxoplasmosis）［1］。剛地弓形蟲速殖子期特異性P30蛋白，也稱表面抗原1（SAG1），能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生IgG、IgM 等多種細(xì)胞因子，具有重要的抗原性［2］。Dzierszinski等［3］研究認(rèn)為P30蛋白可能是決定弓形蟲蟲株毒力的重要因素之一。

喜馬拉雅旱獺是青藏高原分布廣泛的一種野生動物，可傳播鼠疫等致病微生物，嚴(yán)重威脅著當(dāng)?shù)厝诵蟮陌踩?。為了解青海省喜馬拉雅旱獺體內(nèi)弓形蟲病的感染情況，本研究應(yīng)用弓形蟲的重組蛋白GST－SAG1 作為ELISA 診斷抗原，采用ELISA 檢測方法，對青海省祁連縣的92份喜馬拉雅旱獺血清進(jìn)行了弓形蟲病的血清學(xué)檢測，結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青海省某地捕獲旱獺92只，現(xiàn)場心臟采血，立即離心（3 000rpm，15min），分離血清，－20℃條件下冷凍保存待檢。谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S－transferase，GST）和GST－SAG1抗原由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)生物技術(shù)研究室制備。標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽性血清由日本玄學(xué)南博士提供。

1.2 ELISA 方法

1.2.1 重組蛋白的表達(dá)、純化 GST－SAG1融合蛋白采用將編碼T.gondii SAG1 的基因克隆到pGEX－4T－3 質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到E.coli的方法獲取。再用8 M 的尿素緩沖液透析復(fù)性，然后作為診斷抗原在T.gondii的ELISA 檢測中應(yīng)用。

1.2.2 抗原的包被 包被液中（50mM Carbonate－Bicarbonate Buffer，pH 9.6）分別按5μg／mL 劑量加入GST 和GST－SAG1抗原，混勻后以每孔50μL加到96孔平底微量板（Castor）的孔中，并且置4℃條件下孵化過夜。

1.2.3 封 阻 用含有0.05% Tween 20 的1×PBS沖洗液沖洗1 次后，再用含3% 脫脂乳的封阻液（3g脫脂奶粉＋90 mL 蒸餾水＋10 mL 10×PBS）進(jìn)行封阻（每孔100μL），并且置37℃條件下孵化1h。

1.2.4 加 樣 用沖洗液沖洗微量板1 次，將標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽性血清和被檢血請在封阻液中按1∶100滴度稀釋后，每個樣品每孔50μL 平行加到微量板的兩個孔中，且置37 ℃條件下孵化1h。

1.2.5 加二抗 用沖洗液沖洗微量板6 次后，將用辣根過氧化物酶標(biāo)記的Protein A 抗體，在封阻液中按1∶4000 滴度稀釋后每孔加入50μL，且置37 ℃條件下孵化1h。

1.2.6 底 物 用沖洗液沖洗酶標(biāo)板6 次后，每孔加100μL 底物（每1 mL 底物中含有0.3μg ABTS，pH4.0的0.1 M 檸檬酸緩沖液和0.003%過氧化氫），室溫避光孵化1h，在酶標(biāo)儀上讀數(shù)。

1.2.7 讀 數(shù) 用TECAN Sunrise－Basic酶標(biāo)儀（SUNRISE，Swiss）在OD415nm條件下測定光吸收值（OD）。

1.2.8 判定標(biāo)準(zhǔn) 按照管剛等［4］介紹的方法進(jìn)行判定。

2 結(jié)果

本研究從92份喜馬拉雅旱獺血清中，共檢出陽性血清25份，陽性率27.17%。結(jié)果表明青海省祁連縣喜馬拉雅旱獺中存在弓形蟲病的感染。

3 討論

喜馬拉雅旱獺感染弓形蟲病研究具有重要的流行病學(xué)意義。野生動物和家畜及人類共處一個草場，共用相同的水源，感染了弓形蟲的中間宿主野生動物有被人類食用或被終末宿主貓科動物捕食的可能。野生動物感染弓形蟲，構(gòu)成了對人和家畜安全的威脅，所以對野生動物、家養(yǎng)動物、野生動物和家養(yǎng)動物間的相互傳播機理以及動物模型需要做進(jìn)一步研究。

本研究共檢測了92份喜馬拉雅旱獺血清，檢出陽性數(shù)25份，陽性率27.17%，與蔡進(jìn)忠等［5］采用簡接血凝（IHA）對青海家畜弓形蟲病血清抗體檢測結(jié)果相比，高于牦牛的8.03%、羊的7.81%、豬的11.86%。說明弓形蟲在青海省家畜和野生動物體內(nèi)均有感染，而且野生動物感染率明顯高于家畜，雖然這與檢測方法不同等因素有關(guān)，但也提示需研發(fā)更加簡便、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的檢測方法，并對野生動物弓形蟲感染的檢測和防治需要引起高度重視。

［1］El KouniM H.Adenosine metabolism in Toxoplasma gondii：potential targets for chemotherapy［J］.CurrPharJ－Teisai Des，2007，13（6）：581－597.

［2］Seng S，Makala L H，Yokoyama M，et al.SAG1is a hosttargeted antigen for protection against toxoplasma gondii infection［J］.Pathobiology，2004，71（3）：144－151.

［3］Dzierszinski F，Mortuaire M，Cesbron－Delauw M F，et al.Targeted disruption of the glycosylpho sphatidylinositol－anchored surface antigen SAG3gene in Toxoplasma gondii decreases host cell adhesion and drastically reduces virulence in mice［J］.Mol Microbiol，2000，37（3）：574－582.

［4］管 剛，牛小迎，馬利青.豬弓形蟲病的ELISA 診斷及試劑盒建立.中國獸醫(yī)雜志［J］.2008，44（6）：83－84.

［5］蔡進(jìn)忠，李春花.青海家畜弓形蟲病血清學(xué)調(diào)查與流行情況分析［J］.中國獸醫(yī)雜志，2011，47（1）：45－46.