謝 婭 孫紅敏 張 穎 史明星

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，河南 鄭州 450052）

二甲雙胍在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中增強(qiáng)紫杉醇的藥物敏感性

謝 婭 孫紅敏 張 穎 史明星

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，河南 鄭州 450052）

二甲雙胍；子宮內(nèi)膜癌；紫杉醇；藥物敏感性

子宮內(nèi)膜癌是婦科常見惡性腫瘤，占女性腫瘤患者的6%，近些年來子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率呈增加趨勢(shì)[1]。大量證據(jù)表明肥胖、糖尿病和胰島素抵抗是子宮內(nèi)膜癌的危險(xiǎn)因素。隨著人民生活水平的提高，肥胖和糖尿病的發(fā)生率逐年上升[2]。雖然很多子宮內(nèi)膜癌患者可以治愈，但仍有相當(dāng)一部分患者會(huì)復(fù)發(fā)，最終導(dǎo)致四分之一的早期患者和二分之一的晚期患者會(huì)死于子宮內(nèi)膜癌[3]。因此，研究者們一直在尋求治療子宮內(nèi)膜癌的新方法。

子宮內(nèi)膜癌與肥胖、糖尿病密切相關(guān)。由于表觀遺傳或者上游信號(hào)分子的激活，mTOR在許多腫瘤中過度激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化和生存調(diào)節(jié)異常[4,5]。抑癌基因PTEN通過抑制細(xì)胞內(nèi)磷酸酯酶的活性導(dǎo)致（PI3K）-AKT/mTOR信號(hào)通路的抑制，發(fā)揮其抗腫瘤作用。不幸的是，PTEN缺失發(fā)生在30%～83%的子宮內(nèi)膜癌中，促進(jìn)mTOR信號(hào)通路的過度激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化和存活的調(diào)節(jié)異常[6,7]。由于表觀遺傳或者上游信號(hào)分子的激活，mTOR在許多腫瘤（包括子宮內(nèi)膜癌）中過度激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化和生存調(diào)節(jié)異常，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[8-10]。

二甲雙胍是用于治療2型糖尿病的常用的雙胍類降糖藥，特別在肥胖和超重人群中有顯著的治療效果[11]?；谌巳旱恼{(diào)查研究表明在合并有糖尿病的實(shí)質(zhì)惡性腫瘤患者中二甲雙胍對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有保護(hù)作用，并且發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以改善這些腫瘤的預(yù)后并降低[12,13]。Nicole S等發(fā)現(xiàn)合并糖尿病的子宮內(nèi)膜癌的患者服用二甲雙胍可降低子宮內(nèi)膜癌的死亡風(fēng)險(xiǎn)[14]。實(shí)驗(yàn)室研究也表明二甲雙胍有抑制幾種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用（包括乳腺癌、結(jié)腸癌和子宮內(nèi)膜癌）[15,16]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子-I（IGF-I）和胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）促進(jìn)細(xì)胞增殖，然而二甲雙胍抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)[17]。二甲雙胍通常是通過STK11（也稱LKB1）激活A(yù)MPK[18]，激活過程涉及多個(gè)參與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)的信號(hào)通路，其中包括mTOR通路。65%的子宮內(nèi)膜癌中LKB1表達(dá)缺失，從而導(dǎo)致mTOR信號(hào)通路的過度激活[19]。

圖2

圖3

圖4

子宮內(nèi)膜癌的治療原則以手術(shù)聯(lián)合化療、放療。紫杉醇、鉑類、阿霉素類化療藥是目前常用的化療藥物?；熕幬锊幻舾小⒒熌褪艿陌l(fā)生是子宮內(nèi)膜癌患者死亡的主要原因。因此急需找尋一種新的藥物來改善子宮內(nèi)膜癌的化療敏感性。有研究表明，二甲雙胍可以提高子宮內(nèi)膜癌對(duì)順鉑的敏感性。我們的前期研究也表明在體外實(shí)驗(yàn)中二甲雙胍有抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。本次研究的目的是探討二甲雙胍是否可以改善子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，并進(jìn)一步探討與mTOR信號(hào)通路活性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和試劑

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa（IK，高分化）由魏麗慧教授（北京大學(xué)人民醫(yī)院）惠贈(zèng)。細(xì)胞系維持在DMEM/F12添加10%胎牛血清在37 ℃ 5% CO2中。細(xì)胞系常規(guī)3～5 d傳代。二甲雙胍、紫杉醇購(gòu)自Sigma公司。

1.2 細(xì)胞增殖分析

用BrdU-ELISA試劑盒（Roche）檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化。IK8 ×103/孔的濃度接種于96孔板。24 h后，加以不同濃度的二甲雙胍（0.01、0.1、1 mmol/L）聯(lián)合或者紫杉醇（0.001、0.01、0.1 nmol/L）中孵育72 h。對(duì)照組加入相應(yīng)濃度的PBS 或 DMSO。為了進(jìn)一步分析AMPK的作用，用二甲雙胍聯(lián)合或者不聯(lián)合Compound C，0.5、 1 μm孵育細(xì)胞72 h。DNA分析是基于BrdU摻入DNA，然后用免疫分析的方法檢測(cè)。大概過程：孵育以后，細(xì)胞重新用10 μL/well BrdU labeling solution37 ℃孵育2 h，倒掉labeling solution，加入200 μL/well FixDenat 20 ℃孵育30 min，倒掉FixDenat液，加入100 μL/well anti-BrdU-POD工作液20 ℃孵育90 min，然后去除工作液，用洗液洗3次。最后，去除洗液，加入100 μL/well底物液20 ℃孵育20 min，然后加入25 μL的1 mol/L H2SO4，1 min后用450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光值（參考波長(zhǎng)：690 nm），每次3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。同時(shí)用MTT方法驗(yàn)證BrdU技術(shù)的有效性（數(shù)據(jù)中沒有顯示）。

1.3 Western immunoblotting

IK 細(xì)胞以2×105/孔的濃度接種于六孔板中，24 h后加以不同濃度的二甲雙胍（1、10 mmol/L）或者紫杉醇（0.1、1 nmol/L）中孵育48 h，用RIPA（1% NP 40，0.5 sodium deoxycholate and 0.1% SDS）提取細(xì)胞蛋白，加樣于10% SDS-PAGE中，然后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。用5%的脫脂牛奶和0.1% Tween室溫孵育1h，然后用一抗（Cyclin D1，photo-AMPK，total-AMPK，GAPDH）4 ℃孵育（1∶1000；CST）過夜。用PBST洗膜5 min，3次后，HRP連接的二抗（1∶2000；CST）孵育2 h。最后再用PBST洗膜5 min，3次。用ECL試劑盒檢測(cè)硝酸纖維素膜上的條帶。用GAPDH（1∶1000，CST）來校正上樣量。蛋白條帶包括GAPDH，均用Quantity One（Bio-Rad，Hercules，CA）成像程序檢測(cè)光密度值。

1.4 協(xié)同效應(yīng)分析

二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇對(duì)細(xì)胞增殖作用的分析用Calcusyn軟件（Biosoft）中的CI值表示。該軟件是基于Chou和Talalay的中間效應(yīng)分析原則，CI值是兩個(gè)或更多藥物之間相互作用程度的一個(gè)量度標(biāo)準(zhǔn)[20]。CI＞1.1拮抗作用，0.9～1.1累加作用，0.7～0.9微弱協(xié)同作用，0.3～0.7協(xié)同作用，＜0.3強(qiáng)協(xié)同作用。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有的數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)分析用SPSS17.0單因素方差分析，P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 二甲雙胍有抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖的作用，且這種作用能夠被AMPK阻斷劑Compound C削弱

0.1 L和1 mmol/L二甲雙胍能夠顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)（P＜0.05），但這種作用能夠被5×10-7mol/L和1×10-6mol/L的Compound C所削弱（P＞0.05）。見圖1。

Compound C是AMPK的競(jìng)爭(zhēng)抑制子。我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍的抗增殖作用能夠被Compound C削弱（與對(duì)照組相比P＞0.05）。這表明二甲雙胍的抗增殖作用需要AMPK通路的激活。

2.2 紫杉醇抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖

0.001、0.01和0.1 mmol/L的紫杉醇沒有顯著抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖的作用（P＞0.05），但隨著濃度的增加，紫杉醇濃度達(dá)到或超過1 mmol/L時(shí)開始有抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖的作用（P＜0.05）。

2.3 二甲雙胍能夠增強(qiáng)紫杉醇的抗子宮內(nèi)膜癌增殖作用

我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍0.1 mmol/L與不同濃度的紫杉醇（0.001、0.01、0.1、1、10和50 mmol/L）共孵育后顯現(xiàn)出抗增殖作用比單藥明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。藥效最顯著的濃度是0.1 mmol/L二甲雙胍聯(lián)合1 nmol/L紫杉醇（圖3，P＜0.05）。

2.4 二甲雙胍與紫杉醇有協(xié)同抗增殖作用

協(xié)同作用分析結(jié)果表明二甲雙胍和紫杉醇的最大協(xié)同效應(yīng)發(fā)生在0.1 mmol/L二甲雙胍聯(lián)合1 nmol/L紫杉醇（IK：CI=0.356，見表1）。二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇對(duì)細(xì)胞增殖作用的分析用Calcusyn軟件（Biosoft）中的CI值表示。CI＜1提示兩種藥物有協(xié)同作用。0.7～0.9微弱協(xié)同作用，0.3～0.7協(xié)同作用，＜0.3強(qiáng)協(xié)同作用。

表1 二甲雙胍與紫杉醇有協(xié)同抗增殖作用

2.5 二甲雙胍能夠抑制細(xì)胞周期蛋白Cyclin D 1的表達(dá)

IK細(xì)胞以2×105/孔的濃度接種于六孔板中，24 h后加以不同濃度的二甲雙胍（1 mmol/L，10 mmol/L）或者紫杉醇（0.1 nmol/L，1 nmol/L）中孵育48 h，提取細(xì)胞蛋白，檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D 1表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫杉醇對(duì)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)沒有影響，而二甲雙胍能夠抑制細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，得到同樣的結(jié)果。見圖4。

3 討 論

本研究第一次在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中證實(shí)了二甲雙胍能夠增強(qiáng)紫杉醇抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。我們證實(shí)了在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中二甲雙胍通過激活A(yù)MPK抑制細(xì)胞的增殖。們還發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠協(xié)同性的增強(qiáng)紫杉醇的抗子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖作用。并且發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠抑制Cyclin D1的表達(dá)，這可能是二甲雙胍抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的一個(gè)機(jī)制。

子宮內(nèi)膜癌與肥胖、糖尿病密切相關(guān)。由于表觀遺傳或者上游信號(hào)分子的激活，mTOR在許多腫瘤中過度激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化和生存調(diào)節(jié)異常[21]。PI3K/AKT/mTOR通路能夠磷酸酯酶（PTEN）抑制，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。PTEN缺失，加上IGF-Ⅱ和IGF-IR過表達(dá)，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌中mTOR通路過度激活，最終促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制凋亡。二甲雙胍的直接下游靶分子是AMPK，AMPK的激活調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路，其中包括mTOR通路。AMPK通過TSC2的磷酸化抑制mTOR通路調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，最終通過下游的效應(yīng)分子4E-BP1和p70S6K調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯[22]。我們的結(jié)果證實(shí)了二甲雙胍能夠增強(qiáng)紫杉醇的抑制增殖作用，并且二甲雙胍的抑制增殖作用是由于其激活了AMPK，從而削弱了mTOR的過度激活（由于IGF-Ⅱ和IGF-IR的過表達(dá)造成的）。由于AMPK抑制AKT/mTOR信號(hào)通路，因此在AKT信號(hào)過度激活的腫瘤組織中AMPK可能是一個(gè)治療的靶點(diǎn)。既然PTEN缺失在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中發(fā)生率很高進(jìn)而導(dǎo)致AKT信號(hào)過度激活，那么二甲雙胍誘導(dǎo)的AMPK激活可能是一個(gè)獨(dú)特的強(qiáng)有力的抗腫瘤方法。

紫杉醇是常用的治療子宮內(nèi)膜癌的化療藥物，但由于化療劑量所致的化療副作用如消化道反應(yīng)、骨髓抑制等在臨床經(jīng)常發(fā)生，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和患者的依從性。并且化療耐受的發(fā)生時(shí)子宮內(nèi)膜癌的主要致死原因。我們證明了與單用紫杉醇相比，二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇能夠明顯增強(qiáng)抗子宮內(nèi)膜癌增殖作用，并且二甲雙胍與紫杉醇有協(xié)同抗子宮內(nèi)膜癌增殖作用（表1）。同時(shí)我們的結(jié)果表明在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中二甲雙胍通過抑制mTOR抑制子宮內(nèi)膜癌的增殖，并且二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇協(xié)同地抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。因此甲雙胍聯(lián)合紫杉醇可能是一個(gè)有效地治療子宮內(nèi)膜癌的方法，我們希望我們的數(shù)據(jù)能夠?yàn)閷砺?lián)合應(yīng)用二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇治療子宮內(nèi)膜癌提供科學(xué)基礎(chǔ)。進(jìn)一步的聯(lián)合治療療效的體內(nèi)試驗(yàn)和亞臨床實(shí)驗(yàn)使我們將來研究的目標(biāo)。既然肥胖和糖尿病與子宮內(nèi)膜癌的高病死率密切相關(guān)，并且二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇有協(xié)同抑制子宮內(nèi)膜癌增殖的作用，那么二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇可能會(huì)成為治療子宮內(nèi)膜癌的一個(gè)有效方法。

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R737.33

B

1671-8194（2014）13-0073-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（81202070）資助