蔣春波倪道磊金偉民梁國強(qiáng)張露蓉孫偉

（1.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；3.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

滋腎通關(guān)古方對慢性腎盂腎炎大鼠尿SIgA和T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)的影響

蔣春波1，2倪道磊1金偉民1梁國強(qiáng)1張露蓉1孫偉3

（1.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；3.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

目的：觀察滋腎通關(guān)古方對慢性腎盂腎炎大鼠的預(yù)防和治療作用，從免疫學(xué)角度研究慢性腎盂腎炎可能的發(fā)病機(jī)制。方法：大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥治療1組（造模后立即開始灌胃中藥）、中藥治療2組（造模后30天開始灌胃中藥）、西藥組（術(shù)后30天開始灌胃左氧氟沙星），除正常組外建立慢性腎盂腎炎大鼠模型，分別給藥后，觀察各組大鼠尿常規(guī)和尿培養(yǎng)陽性情況，比較尿分泌型免疫球蛋白A（SIgA）、血T淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)。結(jié)果：西藥組、中藥治療1組、中藥治療2組大鼠尿常規(guī)和尿培養(yǎng)陽性率明顯低于模型組；中藥治療1組大鼠尿SIgA明顯高于模型組和西藥組；中藥治療1組大鼠CD3+細(xì)胞數(shù)、CD4+/CD8+比值明顯高于西藥組、中藥治療2組。結(jié)論：早期運(yùn)用滋腎通關(guān)方治療慢性腎盂腎炎模型大鼠，能夠上調(diào)其體內(nèi)CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)、CD4+/CD8+比值，促進(jìn)其尿SIgA的分泌。

滋腎通關(guān)方 慢性腎盂腎炎 尿SIgA 血T淋巴細(xì)胞亞群 實驗研究

慢性腎盂腎炎（classical periarteritis nodusa，CPN）是臨床上一種常見病，常反復(fù)發(fā)作經(jīng)久不愈，防治難度較大且預(yù)后不良。以往對其治療只是在使用抗生素方面下功夫，目的是殺死或抑制病原菌，控制感染。但對免疫功能低下者，單純使用廣譜抗生素不能有效控制感染，長期反復(fù)使用還會導(dǎo)致霉菌感染和耐藥菌株的產(chǎn)生以及菌群失調(diào)[1]，給臨床治療帶來了很多困難。故深入研究系統(tǒng)免疫和黏膜免疫，開展免疫調(diào)節(jié)治療將可能成為一條新途徑[2]。慢性腎盂腎炎多屬中醫(yī)學(xué)“淋證”范疇，病因多為“腎虛膀胱熱”，滋腎通關(guān)丸作為經(jīng)典成方，在淋證治療中應(yīng)用已久，且療效確切。本實驗擬通過建立理想的慢性腎盂腎炎動物模型，選擇尿分泌型免疫球蛋白A（SIgA）和血T細(xì)胞亞群作為觀測指標(biāo)，從黏膜免疫和系統(tǒng)免疫角度來研究慢性腎盂腎炎的免疫損傷機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上研究滋腎通關(guān)方的療效，以期更好地挖掘與開發(fā)古方經(jīng)方。

1 實驗材料

1.1 實驗動物4～6周齡清潔級SD雄性大鼠，40只，體重（200±20）g，由蘇州大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：XCYK（蘇）2002-2008；實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2002-0037。

1.2 菌種致病性大腸桿菌株（E.coli O111B4），蘇州市疾控中心惠贈，利用傾斜平板法制備1×108/mL濃度菌液待用，使用前測集落形成單位（CFU）值核實濃度。

1.3 藥品中藥飲片知母（批號121004）、黃柏（批號120913）、肉桂（批號120824），委托蘇州市中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)藥研究所購買于蘇州春暉堂飲片廠，并由蘇州市中醫(yī)院沈多榮副主任藥師鑒定。知母、黃柏、肉桂按10∶10∶1在蘇州市中醫(yī)院藥劑科煎煮并濃縮成滋腎通關(guān)藥液，每毫升含生藥1.76g。左旋氧氟沙星（左克）膠囊，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)產(chǎn)品，批號：12061427，委托蘇州市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科購買。

1.4 主要試劑與儀器戊巴比妥鈉：Sigma公司生產(chǎn)，批號091022；注射用青霉素G鈉：山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；大鼠分泌型免疫球蛋白A（SIgA）試劑盒，基爾頓生物科技（上海）有限公司，批號：201301；Rat CD3 FITC（批號：E0053290）、Rat CD4 APC（批號：11217150）、Rat CD8 PE（批號：11087001），均為LiankeDio公司生產(chǎn)；其他試劑均為市售分析醇。

酶標(biāo)儀，芬蘭（352型，Labsystems Multiskan MS）；洗板機(jī)，芬蘭（AC8型，Thermo Labsystems）；微量高速離心機(jī)，國產(chǎn)（TG16W）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，國產(chǎn)（GNP-9080型）；流式細(xì)胞儀設(shè)備，型號：FACS Calibur；流式細(xì)胞儀計算機(jī)程序系統(tǒng)軟件：Multi TEST。

2 實驗方法

2.1 造模與分組按文獻(xiàn)[3]方法建立CPN大鼠模型。造模成功的標(biāo)志以結(jié)扎側(cè)腎臟出現(xiàn)以下改變：大體標(biāo)本上粗糙皮質(zhì)瘢痕及相關(guān)腎乳頭收縮和腎盞的擴(kuò)張，鏡下慢性腎間質(zhì)性腎炎改變和腎盂/腎盞炎癥、纖維化。

取SD大鼠40只，按體重隨機(jī)分為5組，每組8只，分別設(shè)為正常組、模型組、西藥治療組、中藥治療1組、中藥治療2組。

正常組：同齡同種在相同條件下飼養(yǎng)的正常鼠。模型組：造模術(shù)后30d開始灌胃給生理鹽水每日1次，每次1mL。西藥組：造模術(shù)后30d，用左氧氟沙星0.1g/kg體重計算藥量（相當(dāng)于成人標(biāo)準(zhǔn)劑量10倍），并將藥品配成所需濃度的懸濁液，灌胃每日1次，每次1mL，連續(xù)30d。中藥治療1組：術(shù)后即用中藥滋腎通關(guān)方水煎劑灌胃（相當(dāng)于成人標(biāo)準(zhǔn)劑量7倍），每毫升含生藥1.76g，每日1次，每次1m L，連續(xù)給藥60d。中藥治療2組：術(shù)后30d，用中藥滋腎通關(guān)方水煎劑灌胃（相當(dāng)于成人標(biāo)準(zhǔn)劑量7倍），每日1次，每次1mL，連續(xù)給藥30d。各組均于造模成功60d后無菌操作下抽取膀胱尿液，腹主動脈采血，檢測相關(guān)指標(biāo)。

2.2 觀察指標(biāo)和方法

2.2.1 尿常規(guī)和尿培養(yǎng)無菌操作下直接抽取膀胱尿液0.5mL，接種于平板培養(yǎng)基上，置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h后，觀察細(xì)菌生長情況。尿培養(yǎng)結(jié)果記錄：細(xì)菌計數(shù)＞100000記為陽性，細(xì)菌計數(shù)＜5000記為陰性。尿常規(guī)結(jié)果記錄：白細(xì)胞＞“+”或有膿球者均記為陽性，少許或無白細(xì)胞記為陰性。

2.2.2 尿SIgA的檢測將收集的尿液，5000g離心15min，4℃，進(jìn)行預(yù)處理，應(yīng)用酶聯(lián)免疫（ELISA）法檢尿SIgA，用試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液5倍稀釋尿液以避免尿液中的干擾物質(zhì)影響檢測，按照說明書指定方法檢測。

2.2.3 T淋巴細(xì)胞亞群的檢測應(yīng)用流式細(xì)胞儀，采用單克隆抗體SPA花環(huán)法測定外周血T淋巴細(xì)胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)使用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。實驗結(jié)果為正態(tài)分布，滿足方差齊性，以（±s）表示，t檢驗采用配對t檢驗和2組獨(dú)立樣本t檢驗，多組間差異顯著性檢驗用單因素方差分析，組間比較用SNK（q）檢驗，各治療組與正常組比較用Dunnett-t檢驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠尿常規(guī)和尿培養(yǎng)的檢測結(jié)果如表1所示，模型組大鼠尿常規(guī)和尿培養(yǎng)陽性數(shù)顯著高于正常組（P＜0.01），說明本實驗造模成功。西藥組、中藥治療1組、中藥治療2組大鼠陽性率明顯低于模型組（P＜0.01，P＜0.05）。西藥組、中藥治療1組、中藥治療2組組間兩兩比較，無顯著性差異。

表1 各組大鼠尿常規(guī)和尿培養(yǎng)檢測結(jié)果只

3.2 各組大鼠尿SIgA檢測結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠尿液分泌型免疫球蛋白A（SIgA）的檢測結(jié)果（±s）

表2 各組大鼠尿液分泌型免疫球蛋白A（SIgA）的檢測結(jié)果（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；與西藥組比較，△△P＜0.01。

組別動物數(shù)（只）尿SIgA（μg/mL）正常組81.51±0.09***模型組8 2.08±0.12西藥組8 2.14±0.06中藥治療1組8 2.91±0.30**△△中藥治療2組8 2.19±0.11

3.3 各組大鼠血液T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)情況結(jié)果見表3。與正常組比較，模型組大鼠CD3+、CD4+細(xì)胞數(shù)明顯降低，CD8+細(xì)胞數(shù)明顯升高，CD4+/CD8+比值明顯下降。與模型組比較，西藥組、中藥治療1組、中藥治療2組大鼠CD4+細(xì)胞數(shù)明顯升高，CD8+細(xì)胞數(shù)明顯下降，CD4+/CD8+比值明顯升高。中藥治療1組與西藥組、中藥治療2組比較，CD3+細(xì)胞數(shù)、CD4+/CD8+比值明顯升高。

表3 各組大鼠血T淋巴細(xì)胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）表達(dá)情況（±s）

表3 各組大鼠血T淋巴細(xì)胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）表達(dá)情況（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與西藥組比較，△P＜0.05；與中藥治療2組比較，#P＜0.05。

4 討論

慢性腎盂腎炎為臨床常見腎臟感染性疾病，是由細(xì)菌感染引起的慢性腎盂和腎實質(zhì)炎癥[4]。過往的研究主要針對抗生素的選擇與使用，目前的研究熱點(diǎn)在其免疫機(jī)制，特別是黏膜免疫。黏膜免疫系統(tǒng)是全身免疫系統(tǒng)的一個重要組成部分，由黏膜局部的黏膜相關(guān)淋巴組織及免疫細(xì)胞共同組成，主要針對經(jīng)黏膜表面進(jìn)入的微生物產(chǎn)生應(yīng)答，抵抗微生物對機(jī)體的侵襲[5]。與所有黏膜免疫系統(tǒng)相同，泌尿生殖道黏膜的黏膜上皮內(nèi)及黏膜下含有大量免疫細(xì)胞。尿SIgA是尿路黏膜免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子，它可以抵抗病原菌在泌尿道黏附[6]，從而使病原菌不能大量在泌尿道繁殖。研究顯示，尿SIgA含量低于正常水平時發(fā)生尿路感染的機(jī)會增加[7]。尿SIgA水平可以作為泌尿系統(tǒng)感染免疫反應(yīng)的表現(xiàn)，也是可能還需要繼續(xù)治療的標(biāo)志。實驗結(jié)果表明，模型組大鼠尿SIgA水平較對照組升高，提示可能與細(xì)菌進(jìn)入尿路黏膜后，刺激黏膜免疫系統(tǒng)分泌SIgA相關(guān)，這是黏膜免疫應(yīng)答的表現(xiàn)。中藥治療1組大鼠尿SIgA較其他各組顯著升高，提示滋腎通關(guān)方早期預(yù)防治療慢性腎盂腎炎能更大程度上調(diào)節(jié)黏膜免疫。

外周血中成熟的T淋巴細(xì)胞主要分為CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞兩個亞群，這兩個亞群相互協(xié)調(diào)，相互平衡。CD4+/CD8+比值維持在一個正常的范圍才能保證免疫功能的正常發(fā)揮，一旦失去平衡就會引起機(jī)體免疫功能紊亂并導(dǎo)致一系列病理變化[8]。CD4+T淋巴細(xì)胞減少時，機(jī)體不能使B淋巴細(xì)胞致敏成漿細(xì)胞，進(jìn)而會使機(jī)體的特異性抗體產(chǎn)生不足，不能及時充分地清除病原菌。CD8+T淋巴細(xì)胞具有直接殺傷被病原菌感染的靶細(xì)胞的功能，同時CD8+的Ts又能抑制機(jī)體免疫應(yīng)答，使機(jī)體產(chǎn)生抗體減少或者是機(jī)體產(chǎn)生抗體不及時，這也不利于機(jī)體對病原菌的清除[9]。CD4+/CD8+比值降低說明機(jī)體CD4+T淋巴細(xì)胞減少，CD8+T淋巴細(xì)胞正?；蛏?，機(jī)體免疫功能紊亂使機(jī)體不能及時產(chǎn)生抗體清除病原菌。本實驗中，與其他各組相比，模型組大鼠CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)降低極為顯著，CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)偏高。這可能提示大鼠在被細(xì)菌侵襲后，體內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞沒有及時有效地釋放出細(xì)胞因子，CD8+T淋巴細(xì)胞的Ts能抑制機(jī)體免疫應(yīng)答，從而不能進(jìn)一步刺激B細(xì)胞成為漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體，使機(jī)體的特異性抗體產(chǎn)生不足，不能及時充分地清除病原菌。與西藥組、中藥治療2組比較，中藥治療1組大鼠CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)值高，CD4+/CD8+比值升高，這也很好地說明了應(yīng)用滋腎通關(guān)方早期預(yù)防治療慢性腎盂腎炎在系統(tǒng)免疫方面療效更顯著。

滋腎通關(guān)丸出自《蘭室秘藏》。方中知母和黃柏名曰“坎離丸”，黃柏瀉下焦腎經(jīng)之火為君，知母滋陰潤燥為佐，兩者相須為用，有補(bǔ)水瀉火、滋陰清熱之功；肉桂溫補(bǔ)腎陽、行氣利水，有助于膀胱氣化功能的恢復(fù)。三者共用可清下焦?jié)駸?，助膀胱氣化?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，知母、黃柏具有抑菌作用；桂皮油對革蘭氏陽性及陰性菌及霉菌有抑制作用。慢性腎盂腎炎可歸屬于中醫(yī)學(xué)“淋證”范疇，淋證之病因多為“腎虛膀胱熱”，這也是滋腎通關(guān)丸的立法依據(jù)。本研究表明，滋腎通關(guān)方治療，特別是早期預(yù)防治療，能夠上調(diào)慢性腎盂腎炎模型大鼠體內(nèi)CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)，促進(jìn)其尿SIgA的分泌。筆者推測這可能與滋腎通關(guān)方組方原則與“腎虛膀胱熱”的病機(jī)相符之故，也進(jìn)一步論證了“腎虛膀胱熱”與黏膜免疫的理論相關(guān)性。

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R692.170.5

A

1672-397X（2014）04-0077-03

蔣春波（1983-），男，博士研究生，主治中醫(yī)師，研究方向：腎臟病的中西醫(yī)結(jié)合診治。jiangjunsz120@163. com

2012-11-01

編輯：吳寧

蘇州市“科教興衛(wèi)”青年科技項目（KJXW2011027）