黃山

·綜述·

分子診斷技術(shù)在心血管疾病診療中的應(yīng)用

黃山★

心血管疾病已成為危害我國人民群眾生命和健康的重大疾病。分子診斷技術(shù)已取得了長足的發(fā)展，可應(yīng)用于心血管疾病診的篩查，實(shí)現(xiàn)治療模式向預(yù)測、預(yù)防及個(gè)體化模式的轉(zhuǎn)變。在心血管疾病診斷方面，可針對不同的疾病需求采用不同的分子診斷策略對相關(guān)疾病進(jìn)行診斷，主要包括免疫法檢測轉(zhuǎn)錄因子、染色體檢測、聚合酶鏈反應(yīng)法檢測外顯因子、基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測、基因突變檢測、致病基因DNA測序、DNA甲基化檢測、miRNA檢測等技術(shù)。在治療及療效監(jiān)測方面，可應(yīng)用分子診斷技術(shù)進(jìn)行相關(guān)的新藥研發(fā)、個(gè)性化藥物治療、治療方案選擇等。同時(shí)，還可以應(yīng)用于疾病的預(yù)后評價(jià)。

分子診斷技術(shù)；心血管疾??；應(yīng)用

近年來，心血管疾病的發(fā)病率和死亡率急劇增加，已成為危害我國人民群眾生命和健康的重大疾病。分子診斷學(xué)是以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，利用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子和大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化，為疾病的預(yù)防、預(yù)測、診斷、治療和轉(zhuǎn)歸提供信息和決策依據(jù)的一門學(xué)科。分子診斷已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)的一個(gè)重要組成部分，其內(nèi)容從初期的單一診斷遺傳性疾病發(fā)展到一個(gè)全新階段，廣泛應(yīng)用于感染性疾病、腫瘤及遺傳性疾病診斷等多個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。相對于感染性疾病、遺傳性疾病和腫瘤性疾病的分子診斷，分子診斷技術(shù)在心血管疾病的應(yīng)用較為滯后，但也取得了不菲的成績，現(xiàn)綜述如下。

1 分子診斷技術(shù)的發(fā)展

分子診斷就是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。分子診斷以基因作為檢查材料和探查目標(biāo)，屬于“病因診斷”，針對性強(qiáng)。分子診斷的常用技術(shù)方法有：①核酸分子雜交技術(shù)，包括Southern印跡（southern blot雜交），Northern印跡（Northern blot雜交），斑點(diǎn)雜交（dot blot），原位雜交（insituhybridization）等；②PCR及相關(guān)應(yīng)用技術(shù)，包括等位基因特異寡核苷酸探針（ASO）雜交法、單鏈構(gòu)象多態(tài)（SSCP）分析、DNA限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析、微衛(wèi)星DNA分析技術(shù)等；③基因測序，是基因突變檢測的最直接，最準(zhǔn)確的方法，它不僅可確定突變的部位，還可確定突變的性質(zhì)；④基因組學(xué)及分析技術(shù)，包括基因芯片、DNA微陣列（DNAmicroarray）技術(shù)等，利用核酸分子雜交原理，可用于大規(guī)模篩選和基因表達(dá)研究；⑤蛋白質(zhì)組學(xué)及分析技術(shù)，作為功能基因組研究的重要支柱，研究的是在不同時(shí)間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體，從而揭示和說明生命活動(dòng)的基本規(guī)律；⑥熒光原位雜交染色體分析技術(shù)（FISH），這項(xiàng)實(shí)用技術(shù)不僅可用于基因在染色體上的定位研究，而且可直接用于實(shí)驗(yàn)室診斷；⑦波譜核型分析技術(shù)（Spectral karyotyping，SKY），主要用于腫瘤細(xì)胞的遺傳學(xué)分析，檢測復(fù)雜的細(xì)胞遺傳學(xué)異常，也可用于比較細(xì)胞遺傳學(xué)的種間進(jìn)化差異性研究等方面；⑧分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展及作用，其中應(yīng)用較多的有：一是毛細(xì)管電泳技術(shù)（capillary electrophoresis，CE），現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于病原體、腫瘤和遺傳病的基因診斷，如病原體特異基因檢測、基因突變檢測、DNA序列分析等；二是液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)（LC／MS／MS），可在短時(shí)間內(nèi)通過檢測血液中氨基酸或?；鈮A水平異?？煽焖俸Y選出近30種基因遺傳性代謝紊亂疾病，在多肽、激素、寡核苷酸以及藥物成分分析等方面應(yīng)用廣泛；三是變性高效液相色譜技術(shù)，可自動(dòng)檢測單堿基替代及小片段核苷酸的插入或缺失。

2 分子診斷技術(shù)在心血管疾病診療中的應(yīng)用

2．1在篩查心血管疾病中的應(yīng)用

基因篩查并非金標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)突變并不能完全預(yù)測、預(yù)后或確診，因?yàn)橛行┲虏』驍y帶者可能終生不發(fā)病，尤其是錯(cuò)義突變，需要進(jìn)一步進(jìn)行功能研究。但是基因篩查相對于臨床診斷有很好的時(shí)效性，可以在發(fā)病前或在出現(xiàn)嚴(yán)重臨床事件前及時(shí)采取相應(yīng)的預(yù)防措施，降低猝死率。每一種檢查都有一定的特異度和靈敏度，不能將各種疾病不完全外顯造成假陽性而完全否定基因診斷的前景，存在致病基因突變有進(jìn)一步發(fā)展致病的易感性，因此對于這部分病人建議進(jìn)行跟蹤隨訪。盡管目前研究還不能明確肯定特定基因突變對患者臨床及預(yù)后的價(jià)值，但基因篩查對心血管患者的診斷和臨床治療仍具有不可估量的意義。

應(yīng)用分子診斷技術(shù)進(jìn)行疾病篩查，可以實(shí)現(xiàn)目前的診斷——治療模式，轉(zhuǎn)向預(yù)測——預(yù)防及個(gè)體化模式。應(yīng)用分子診斷技術(shù)，可對部分心血管疾病進(jìn)行篩查。青少年猝死的常見原因?yàn)榉屎裥托募〔　Ｉ钊肓私夥屎裥托募〔〉倪z傳基礎(chǔ)對理解這種最常見的心血管遺傳疾病及給予最適合的處理具有重要意義。肥厚型心肌病發(fā)病涉及的基因有很多種，每種基因的突變部位又分布在不同的外顯子及內(nèi)含子上，因此，對肥厚型心肌病進(jìn)行人群篩選，必須尋找一種經(jīng)濟(jì)方便的方法。應(yīng)用分子診斷技術(shù)進(jìn)行基因篩查改變了傳統(tǒng)的HCM診斷方法，患者可以不依賴心室肥厚，而在發(fā)病以前就可以得到診斷（臨床前診斷）［1］。2010年Voelkerding等人報(bào)道：應(yīng)用新一代測序技術(shù)Next generation sequencing（NGS）為肥厚性心肌病的篩查及診斷提供了新方法。學(xué)者們用長片段PCR技術(shù)擴(kuò)增HCM中的基因片段，發(fā)現(xiàn)Myosin，heavy chain 6、7（MYH6、7）、Myosin，light chain 2、3（MYL2、3）等16個(gè)基因中共有455個(gè)突變點(diǎn)可以用來篩查HCM，提高了疾病篩查的敏感性［2］。

現(xiàn)在的研究也表明，致心律失常性右室心肌病（ARVC）是一種橋粒病，橋粒功能異常是致病的最后通路，非橋?；蚩赡芡ㄟ^影響橋粒發(fā)揮作用，而非橋?；蚱駷橹拱l(fā)現(xiàn)的家系及突變數(shù)目有限，因此建議先篩查橋粒成分基因，可對ARVC進(jìn)行篩查［3］。2013年Campuzano等人針對家族中有成員發(fā)生心臟性猝死的15個(gè)西班牙家族進(jìn)行基因檢測及全身體格檢查后發(fā)現(xiàn)，DSP_p．Q986X的遺傳變異對致心律失常性右室心肌病的發(fā)生具有預(yù)示意義［4］。對于原發(fā)性高血壓，盡管沒有一個(gè)研究能夠明確的易感基因，但是，針對多個(gè)基因的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行篩查分析，可以實(shí)現(xiàn)在分子生物水平預(yù)防和治療原發(fā)性高血壓［5］。

2．2在診斷心血管疾病中的應(yīng)用

對不同的疾病需要采用不同的基因診斷策略，以求達(dá)到最佳的診斷效能。目前分子診斷技術(shù)對于心血管疾病的基因診斷，主要應(yīng)用于以下幾個(gè)方面：

2．2．1免疫法檢測轉(zhuǎn)錄因子

免疫法檢測轉(zhuǎn)錄因子是將預(yù)先制備好的與相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的雙鏈DNA通過核酸粘附液包被于酶鏈板孔中，與待測樣品充分反應(yīng)后，進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的免疫反應(yīng)及顯色反應(yīng)，從而達(dá)到檢測核轉(zhuǎn)錄因子活性的目的。本項(xiàng)分子診斷技術(shù)中DNA的包被不需特殊的預(yù)活化試劑和特殊的表面，具有包被省時(shí)、檢測過程簡便、無需特殊的儀器設(shè)備、適合作高通量檢測、無放射性污染、靈敏度高和定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

與心臟發(fā)育、生長相關(guān)的遺傳因素可直接導(dǎo)致許多心臟疾病的形成。轉(zhuǎn)錄因子Nkx2．5是心臟前體細(xì)胞分化的最早期標(biāo)志之一，與心臟發(fā)育密切相關(guān)，Nkx2．5基因突變導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生。2013年Huang通過免疫法和基因及基因功能分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Nkx2．5基因上游增強(qiáng)子的兩個(gè)雜合DNA變異序列對小部分室間隔缺損的先天性心臟病發(fā)揮作用，通過這樣的遺傳研究能為先心病的治療提供策略［6］。

2．2．2聚合酶鏈反應(yīng)法檢測外顯因子

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。PCR能快速特異擴(kuò)增任何已知目的基因或DNA片段，并能輕易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因擴(kuò)增達(dá)到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此，PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷等諸多方面。

GATA-4基因與先天性心臟病關(guān)系密切，在心臟的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，它的單個(gè)或多個(gè)基因的突變及異常表達(dá)均可能會導(dǎo)致心臟畸形的發(fā)生，如房間隔缺損、法洛四聯(lián)癥、室間隔缺損等［7］，應(yīng)用PCR技術(shù)對血液標(biāo)本中GATA-4基因3，4，5，6外顯子4對引物進(jìn)行PCR檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠中電泳，可進(jìn)行定性定量分析，即可對CHD進(jìn)行診斷。另外，2013年最新研究發(fā)現(xiàn)，Wei等人通過PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)GATA-5基因中有兩個(gè)雜合突變位點(diǎn)p．R187G和p．H207R，均可導(dǎo)致法洛四聯(lián)癥的發(fā)生，并為人法洛四聯(lián)癥的早期預(yù)防和等位基因治療法提供策略［8］。

2．2．3基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測

SNP是一種最常見的可遺傳變異，可分為兩種形式，一是基因編碼區(qū)的SNP，稱為cSNP；二是遍布于基因組的大量單堿基變異，已廣泛地應(yīng)用于疾病的連鎖分析及關(guān)聯(lián)分析、腫瘤的雜合性缺失研究、疾病遺傳機(jī)制研究、個(gè)性化用藥研究等諸多領(lǐng)域。例如，致心律失常性右室心肌?。ˋRVC），可以對PKP-2、TGFB-3和DSP［9］等相關(guān)突變基因進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測，分析基因型的差異，以探討其基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性。也可以將檢測結(jié)果通過與人類基因組序列多態(tài)性數(shù)據(jù)庫（dbSNP）進(jìn)行序列比較，選擇相應(yīng)的多態(tài)性位點(diǎn)并在家系其他成員中進(jìn)行序列測定和比較分析，可得出相應(yīng)的結(jié)論。

2．2．4基因突變檢測

根據(jù)心血管疾病相關(guān)的目標(biāo)基因，提取病人基因組DNA，可應(yīng)用基因擴(kuò)增和單鏈構(gòu)象多態(tài)分析（PCR-SSCP）等分析技術(shù)，與正常對照組比較，即可對突變基因進(jìn)行檢測。同時(shí)，還可將擴(kuò)增產(chǎn)物上高效液相色譜技術(shù)（DHPLC）進(jìn)行分析，與正常組比較，分析其差異性，只要存在差異便可認(rèn)為有異常。PCR-SSCP是在不測序情況下檢測核酸變異的敏感方法。SSCP突變檢出敏感性35％～100％不等，當(dāng)DNA片段長度在300 bp以內(nèi)時(shí)，SSCP分析檢測基因突變的準(zhǔn)確性為90％～100％。采用SSCP分析與毛細(xì)管電泳方法相結(jié)合技術(shù)，結(jié)果可使基因突變的檢出敏感性達(dá)100％，并具有高通量檢測的優(yōu)點(diǎn)。例如，對先天性長QT綜合征（CLQTS），可對其中的LQT1-3（KCNQ1、KC-NH2、SCN5A）等相關(guān)突變基因進(jìn)行檢測，分析基因型的差異，即可對這種遺傳學(xué)心肌病進(jìn)行診斷［10］。

2．2．5致病基因DNA測序

DNA測序技術(shù)使直接檢測核苷酸突變成為可能，而不僅僅是基因片段的多態(tài)性分析，使臨床分子診斷更加精確。常用于探針設(shè)計(jì)、特異引物合成、基因結(jié)構(gòu)分析等，在遺傳病診斷、微生物種屬鑒定、腫瘤診斷等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，人類基因組計(jì)劃就是由于大規(guī)模自動(dòng)化測序技術(shù)的發(fā)展而順利完成的。但由于DNA測序方法復(fù)雜，一般臨床實(shí)驗(yàn)室無法進(jìn)行，有必要時(shí)可委托有條件的公司或研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行。各種基因序列可由Genbank上獲得，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可以進(jìn)行測序檢測，通過與人類基因組序列數(shù)據(jù)庫（Build 36．3）進(jìn)行序列比較，也可將測序結(jié)果與正常序列進(jìn)行比對，即可得出結(jié)果。目前大部分遺傳性高血壓的基因診斷多依賴于直接的DNA測序技術(shù)，通過對致病基因的序列分析，可發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致基因功能異常的各種形式的突變。

2．2．6DNA甲基化檢測

很多研究顯示，基因表觀遺傳學(xué)的改變與動(dòng)脈粥樣硬化有著密切的關(guān)系［11］，例如誘導(dǎo)同型半胱氨酸含量升高，可以改變?nèi)搜芷交〖?xì)胞DNA甲基化的改變，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，異常的DNA甲基化使血管平滑肌細(xì)胞增殖，并從中膜遷移至內(nèi)膜參與形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。除全基因組DNA甲基化的變化與冠心病相關(guān)，一些特異性的基因甲基化也影響動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，如雌激素受體基因、P53基因、細(xì)胞外超氧化物歧化酶基因等。通過對動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)DNA的甲基化水平進(jìn)行檢測，即可了解動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。常用的甲基化檢測方法有：限制性內(nèi)切酶法、亞硫酸氫鹽處理法和DNA芯片技術(shù)等。同樣的方法可以應(yīng)用于原發(fā)性高血壓的診斷。

2．2．7miRNA檢測

miRNAs參與調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因素，包括內(nèi)皮細(xì)胞的生長、分化、死亡和凋亡，以及內(nèi)皮祖細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子、脂質(zhì)的調(diào)節(jié)等，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展［12］。對相關(guān)的miRNAs進(jìn)行檢測，可對動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后進(jìn)行診斷，目前國內(nèi)外miRNA檢測方法主要有：miRNA芯片、高通量測序法（Illina／Solexa）、Northern blot法和熒光實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（QRT-PCR）法等。最新研究發(fā)現(xiàn)，Li等人通過qRT-PCR的方法證實(shí)MicroRNA-663是調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞表型的改變的開關(guān)，同時(shí)可以調(diào)節(jié)血管新生內(nèi)膜的形成，從而影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展［13］。

2．3在治療心血管疾病中的應(yīng)用

2．3．1新藥研發(fā)應(yīng)用

由于大部分心血管疾病與基因相關(guān)，而且往往與多基因相關(guān)，因而，利用DNA芯片可以尋找基因與疾病的相關(guān)性，從而研制出相應(yīng)的藥物和提出新的治療方法。新藥物的開發(fā)常需篩選上千種化合物，在尋找作用于蛋白質(zhì)的藥物時(shí)，如利用靶蛋白制成芯片來直接篩選與其作用的化合物，將極大地提高藥物開發(fā)的效率，實(shí)現(xiàn)高通量和自動(dòng)化。同時(shí)，蛋白質(zhì)芯片有助于研究藥物與其效應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)之間的相互作用，也是尋找藥物作用靶點(diǎn)的有力工具。

2．3．2個(gè)性化藥物治療

藥物基因組學(xué)（pharmacogcnomics）是一門基于功能基因組學(xué)與分子藥理學(xué)的科學(xué)，它從基因水平研究基因多態(tài)性與藥物效應(yīng)多樣性之間的關(guān)系。應(yīng)用藥物基因組學(xué)可以指導(dǎo)個(gè)體化醫(yī)療（personalized medicine）方案的制定，提高用藥的安全性和有效性，避免嚴(yán)重不良反應(yīng)，減少藥物治療的風(fēng)險(xiǎn)和費(fèi)用。同時(shí)，可以根據(jù)藥物基因多態(tài)性檢測結(jié)果選擇適合的治療藥物，避免一些副作用的發(fā)生。還可以根據(jù)藥物代謝酶的基因多態(tài)性設(shè)計(jì)合適的用藥劑量。例如，先天性長QT綜合征（CLQTS）是一種以編碼離子通道基因突變?yōu)榛A(chǔ)的遺傳性疾?。?4］，其治療必須針對各個(gè)遺傳背景的差異而選擇針對性的個(gè)體化治療。

2．3．3治療方案選擇

兒茶酚胺敏感性多形性室性心動(dòng)過速（CPVT）是一種遺傳性心肌病，基因檢測對該病的診治至關(guān)重要。癥狀發(fā)生前獲得該病遺傳學(xué)診斷可及時(shí)對此種高致命性疾病進(jìn)行預(yù)防，對疑似患者的早期診斷和治療非常重要，如果診斷RyR2突變，可進(jìn)行性別危險(xiǎn)分層，男性患者預(yù)后更差，因此對該組人群應(yīng)進(jìn)行有效監(jiān)測和積極治療。

2．4預(yù)后評價(jià)

隨著肥厚性心肌病（HCM）致病基因的不斷發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行了不少基因型與表型及預(yù)后關(guān)系的分析研究［15］，提出分子診斷可能會對患者的危險(xiǎn)度分層有幫助，尤其是對猝死危險(xiǎn)性，并且提出了“良性突變”和“惡性突變”的觀點(diǎn)。有些基因突變的攜帶者癥狀出現(xiàn)晚或癥狀輕微，甚至可正常存活，如A-原肌凝蛋白及cTnI上的某些突變；而有些突變攜帶者癥狀出現(xiàn)早，病情嚴(yán)重，甚至發(fā)生猝死，報(bào)道較多的為cTnT和B-MHC上的某些基因突變。既往研究表明肌球蛋白結(jié)合蛋白C基因突變攜帶者預(yù)后較好，而B-MHC基因突變預(yù)后較差，cTnT基因突變攜帶者雖然心臟肥厚不明顯，但猝死發(fā)生率高。常規(guī)對HCM患者進(jìn)行基因突變位點(diǎn)篩查可以提供重要的診斷和預(yù)后信息。

總之，分子診斷技術(shù)在心血管疾病診療上的應(yīng)用，可實(shí)現(xiàn)以下幾個(gè)方面的轉(zhuǎn)變。第一，可實(shí)現(xiàn)治療模式的轉(zhuǎn)變，從注重疾病診治到對生命全過程的健康監(jiān)測，重預(yù)防，治未病。第二，可實(shí)現(xiàn)學(xué)科研究重點(diǎn)的前移，從生命后期前移至生命前期，疾病發(fā)生之前以至個(gè)體發(fā)生之前，控制出生缺陷。第三，可推行個(gè)性化治療。但是，我們也要清醒的認(rèn)識到，分子診斷技術(shù)在心血管疾病的診療上還處于初級階段，離臨床的推廣應(yīng)用還有很長一段距離，也應(yīng)成為醫(yī)學(xué)科學(xué)工作者奮斗的目標(biāo)。

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The application of molecular diagnostic techniques in the diagnosis and treatment of cardiovascular disease

HUANG Shan
（Guizhou Province Center for Clinical Laboratory，Guizhou，Guiyang 550002，China）

Cardiovascular disease has become one of the most serious disease endangering people′s life and health in our country．Molecular diagnostic techniques have made great progress，which can be applied to screening for cardiovascular disease diagnosis and achieved paradigm shift from treatment to prediction，prevention and individualized．In cardiovascular disease diagnosis，molecular diagnostic technology can be applied according to different molecular diagnostic strategy for the diagnosis of related diseases，mainly including transcription factor immunoassay，chromosome testing，polymerase chain reaction detection of exon factor，gene single nucleotide polymorphism（SNP）detection，gene mutations，causative gene DNA sequencing，DNA methylation detection，miRNA detection technology．In terms of treatment and monitoring of curative effect，molecular diagnostic technology can be applied in new drug research and development，the selection of personalized medicine therapy and treatment options，etc．Meanwhile，it also can be used in the disease prognosis appraisal．

Molecular diagnostic techniques；Cardiovascular disease；Application

貴州省臨床檢驗(yàn)中心，貴州，貴陽550002

★通訊作者：黃山，E-mail：huangshan263＠sina．com