毛浩萍，牛子長(zhǎng)，王興業(yè)，邱燕榮

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193；2天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

補(bǔ)骨脂酚對(duì)人腎上腺皮質(zhì)癌H295R細(xì)胞中睪酮和雌二醇分泌的影響*

毛浩萍1，牛子長(zhǎng)2，王興業(yè)1，邱燕榮1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193；2天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

[目的]研究補(bǔ)骨脂酚對(duì)人腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞（H295R）睪酮及雌二醇分泌的影響。[方法]實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組及補(bǔ)骨脂酚不同濃度組，分別使用CCK-8法及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測(cè)補(bǔ)骨脂酚對(duì)H295R細(xì)胞活力、睪酮和雌二醇分泌的影響；同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（Real-time PCR）檢測(cè)補(bǔ)骨脂酚對(duì)睪酮和雌二醇合成酶CYP17A1和CYP19A1 mRNA表達(dá)的影響。[結(jié)果]補(bǔ)骨脂酚對(duì)睪酮合成酶CYP17A1 mRNA無顯著影響，但能上調(diào)雌二醇合成酶CYP19A1 mRNA含量，具有減少睪酮分泌增加雌二醇分泌的作用。[結(jié)論]補(bǔ)骨脂酚促進(jìn)H295R細(xì)胞中雌激素的產(chǎn)生。

補(bǔ)骨脂酚；腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞；睪酮；雌二醇

補(bǔ)骨脂為補(bǔ)陽(yáng)類中藥，具有補(bǔ)腎助陽(yáng)，固精縮尿，暖脾止瀉，納氣平喘的功效。中醫(yī)臨床主要用于腎陽(yáng)不足，命門火衰，腰膝冷痛，脾腎陽(yáng)虛，泄瀉及腎不納氣的虛喘等癥的治療?，F(xiàn)代化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂含有多種活性成分，包括香豆素類、黃酮類、單萜酚類及尿嘧啶、豆甾醇類化合物等[1-3]。補(bǔ)骨脂酚是補(bǔ)骨脂中一個(gè)含量較高的單萜酚類化合物，補(bǔ)骨脂酚在補(bǔ)骨脂中含量較高，約為1%～7%。研究顯示補(bǔ)骨脂酚具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗腫瘤及肝保護(hù)等作用[4-7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂酚具有植物雌激素樣作用，能劑量依賴性激活雌激素受體α（ERα）和雌激素受體β（ERβ），且對(duì)ERβ表現(xiàn)出很強(qiáng)的選擇性[8]。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂酚能雙向調(diào)節(jié)牛腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞兒茶酚胺分泌，提示補(bǔ)骨脂酚可能具有抗抑郁樣作用[9]。補(bǔ)骨脂酚經(jīng)由雄激素受體抑制雄激素依賴的前列腺癌細(xì)胞增殖[10]。腎上腺皮質(zhì)中，酶CYP19A1能催化睪酮生成雌激素雌二醇[11]。補(bǔ)骨脂酚是否能調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)中雌激素的分泌未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究使用人腎上腺皮質(zhì)癌H295R細(xì)胞，分別采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（Real-time PCR）檢測(cè)補(bǔ)骨脂酚對(duì)H295R細(xì)胞中睪酮和雌二醇分泌及上述類固醇激素合成的催化酶mRNA含量的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 H295R細(xì)胞購(gòu)自ATCC（美國(guó)），補(bǔ)骨脂酚由本課題組自補(bǔ)骨脂中提取分離，經(jīng)高效液相色譜法分析其中補(bǔ)骨脂酚純度大于97%?；A(chǔ)培養(yǎng)液DMEM/F12（Gibco，美國(guó)），雙抗（75 U/mL青霉素，75 μg/mg鏈霉素，Hyclone），Ⅳ組分無血清培養(yǎng)物（Nu-serumⅣ）及胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸鈉（ITS）細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充物購(gòu)自BD公司，0.25%胰蛋白酶（Gibco，美國(guó)），細(xì)胞活力試劑盒（CCK-8）（日本同仁公司），睪酮及雌二醇ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自DRG，cDNA合成試劑盒（TaqMan Reverse Transcription Rengents）購(gòu)自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自羅氏。CYP17A1 ANP mRNA引物序列：AGCCGCACACC AACTATCAG（上游），TCACCGATG CTGGAGTCAAC（下游）；CYP19A1 mRNA引物序列：AGGTGCTAT TTGTCATCTGCTC（上游），TGGTG GAATCGGGTCT TTATGG（下游）；人GAPDH mRNA引物序列：AGGT CGGAGTCAACGGATTTGG（上游），GCTCCTGGAAG ATGGTGATGGG（下游）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞完全培養(yǎng)：全培基含97.5%的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，2.5%無血清培養(yǎng)物Nu-serum IV及0.1%的ITS細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充物。H295R細(xì)胞株培養(yǎng)于上述完全培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，每4～5 d按1∶4傳代1次。每周換液2～3次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 H295R細(xì)胞胰酶消化后使用完全培養(yǎng)基種于24孔板或12孔板中。24 h后分為對(duì)照組及補(bǔ)骨脂酚10-7、3×10-7、10-6、3×10-6、10-5mol/L濃度組。

1.4 補(bǔ)骨脂酚對(duì)H295R細(xì)胞活性的影響 調(diào)整細(xì)胞濃度為105個(gè)/mL種于96孔板中，24 h后細(xì)胞加入不同濃度的補(bǔ)骨脂酚（終濃度為10-7、3×10-7、10-6、3×10-6、10-5mol/L）孵育24 h。棄上清，加入CCK-8（終濃度V∶V 1∶10）孵育0.5 h后，450 nm處測(cè)定吸光值。

1.5 細(xì)胞分泌的睪酮和雌二醇含量的檢測(cè) 調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL，種于12孔板中過夜，根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇對(duì)細(xì)胞活性無顯著變化的補(bǔ)骨脂酚濃度（終濃度為10-7、3×10-7、10-6mol/L）孵育24 h。1 000 r/min離心5 min后取細(xì)胞上清按ELISA試劑盒說明檢測(cè)睪酮和雌二醇含量。

1.6 Real-time PCR法檢測(cè)CYP17A1和CYP19A1 mRNA含量 調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL，種于12孔板中過夜，根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇對(duì)細(xì)胞活性無顯著變化的補(bǔ)骨脂酚濃度（終濃度為10-7，3×10-7、10-6mol/L）孵育24 h。1 000 r/min離心5 min后棄上清，提取細(xì)胞總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒及擴(kuò)增試劑盒操作進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min,40個(gè)循環(huán)。循環(huán)擴(kuò)增結(jié)束后，記錄各組Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算各組相對(duì)mRNA含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料組間比較采用單因素方差，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)骨脂酚對(duì)H295R細(xì)胞活性的影響 與空白對(duì)照組相比，3×10-6、10-5mol/L補(bǔ)骨脂酚顯著抑制H295R細(xì)胞活性（P＜0.01）；10-7、3×10-7、10-6mol/L補(bǔ)骨脂酚孵育24 h對(duì)H295R細(xì)胞活性無顯著影響，見表1。因此，選擇使用10-7、3×10-7、10－6mol/L補(bǔ)骨脂酚進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 補(bǔ)骨脂酚對(duì)H295R細(xì)胞中睪酮和雌二醇分泌的影響 與空白對(duì)照組比較，補(bǔ)骨脂酚（10-7、3×10-7、 10-6mol/L）顯著抑制H295R細(xì)胞中睪酮分泌（P＜0.01），見表2。與空白對(duì)照組相比，補(bǔ)骨脂酚（3×10-7、10-6mol/L）顯著促進(jìn)H295R細(xì)胞中雌二醇分泌（P＜0.01），見表2。

表1 補(bǔ)骨脂酚對(duì)H295R細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 補(bǔ)骨脂酚對(duì)H295R細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組相比，**P＜0.01。n=3，重復(fù)3次，結(jié)果趨勢(shì)一致。

組別 濃度（mol/L） 吸光值空白對(duì)照組- 0.259 2±0.019 2補(bǔ)骨脂酚 3×10-70.244 7±0.012 9 3×10-70.241 7±0.012 9 3×10-60.235 8±0.028 9 3×10-60.208 6±0.018 9** 3×10-50.122 6±0.019 1**

表2 補(bǔ)骨脂酚對(duì)H295R細(xì)胞睪酮和雌二醇分泌的影響（±s） %

表2 補(bǔ)骨脂酚對(duì)H295R細(xì)胞睪酮和雌二醇分泌的影響（±s） %

注：與空白對(duì)照組相比，**P＜0.01。n=3，結(jié)果重復(fù)3次，趨勢(shì)一致。

組別 濃度（mol/L） 睪酮 雌二醇空白對(duì)照組- 100.00±7.96 100.00±16.33補(bǔ)骨脂酚 3×10-7080.81±9.81** 109.53±19.02 3×10-7064.78±4.01** 126.92±10.07** 3×10-6060.11±7.04** 138.62±17.77**

2.3 補(bǔ)骨脂酚對(duì) H295R細(xì)胞中 CYP17A1和CYP19A1mRNA表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，補(bǔ)骨脂酚（10-7、3×10-7、10-6mol/L）對(duì)H295R細(xì)胞中CYP17A1mRNA表達(dá)無顯著影響。與空白對(duì)照組相比，補(bǔ)骨脂酚（3×10-7、10-6mol/L）顯著上調(diào)H295R細(xì)胞中CYP19A1 mRNA表達(dá)（P＜0.01），見表3。

表3 補(bǔ)骨脂酚對(duì)H295R細(xì)胞CYP17A1和CYP19A1mRNA表達(dá)的影響（±s）

表3 補(bǔ)骨脂酚對(duì)H295R細(xì)胞CYP17A1和CYP19A1mRNA表達(dá)的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組相比，**P＜0.01。n=3，結(jié)果重復(fù)3次，趨勢(shì)一致。

組別 濃度（mol/L） CYP17A1 mRNA CYP19A1 mRNA空白對(duì)照組- 1.00±0.10 1.01±0.17補(bǔ)骨脂酚 10-71.02±0.02 1.01±0.09 3×10-70.94±0.06 1.52±0.09** 10-61.01±0.02 2.02±0.46**

3 討論

H295R細(xì)胞來源于人腎上腺皮質(zhì)瘤，它具有上皮細(xì)胞的形態(tài)，呈單層貼壁生長(zhǎng)。所有類固醇激素合成過程必需的催化酶均在H295R細(xì)胞中有表達(dá)，因而H295R細(xì)胞具有分泌各種腎上腺皮質(zhì)激素的特性，如能分泌孕激素、雄激素、雌激素、糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素等[12]。同時(shí)它對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)水平與正常的人腎上腺細(xì)胞對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)水平相比是一致的。因此，H295R細(xì)胞系成為了體外篩選具有調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)類固醇激素作用相關(guān)藥物的有力工具[13]，同時(shí)也為體外研究藥物調(diào)節(jié)類固醇激素分泌的作用機(jī)制提供了可能。

腎上腺皮質(zhì)能分泌包括鹽皮質(zhì)類固醇、糖皮質(zhì)激素類固醇以及腎上腺性激素等多種調(diào)節(jié)機(jī)體物質(zhì)代謝相關(guān)的激素，參與機(jī)體對(duì)一切有害刺激的應(yīng)激反應(yīng)。腎上腺皮質(zhì)中的各種皮質(zhì)類固醇激素均由統(tǒng)一的前體膽固醇在不同合成酶的催化下合成而來。研究顯示腎上腺皮質(zhì)中的雄性激素睪酮能在酶CYP19A1的催化下生成雌二醇。正常生理?xiàng)l件下，腎上腺皮質(zhì)并非是雌激素的直接重要來源。但是，婦女進(jìn)入更年期后卵巢功能逐步衰退導(dǎo)致體內(nèi)雌二醇水平急劇下降，此時(shí)從腎上腺皮質(zhì)雄激素轉(zhuǎn)化而來的雌二醇是絕經(jīng)期后婦女體內(nèi)雌二醇的主要來源。研究顯示補(bǔ)骨脂中多種成分具有類雌激素樣作用[14-15]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂酚具有類雌激素樣作用，當(dāng)前研究顯示補(bǔ)骨脂酚顯著抑制H295R細(xì)胞中睪酮分泌，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞雌二醇分泌。檢測(cè)上述兩種類固醇激素合成酶CYP17A1和CYP19A1 mRNA含量發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂酚對(duì)睪酮合成的催化酶CYP17A1 mRNA水平無明顯影響，顯著提高雌二醇合成酶CYP19A1 mRNA，提示補(bǔ)骨脂酚調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)中雌性激素分泌的作用可能與調(diào)節(jié)雌二醇合成酶CYP19A1 mRNA水平有關(guān)，這與補(bǔ)骨脂改善初老小鼠體內(nèi)雌孕激素水平等作用的報(bào)道是一致的[16]。

雌激素尤其是17β-雌二醇是許多靶組織生長(zhǎng)、分化以及行使生物學(xué)功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究顯示雌激素具有降血脂、抗氧化、保護(hù)內(nèi)皮、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等活性，雌激素還能調(diào)節(jié)CA類神經(jīng)遞質(zhì)的合成、分泌及重吸收，從而具有心血管保護(hù)、抗抑郁等作用[17-18]。課題組研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂酚能顯著促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)中的雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化，從而上調(diào)雌激素的分泌水平，課題組以往的研究也發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂酚具有潛在的抗抑郁樣作用[6]，其作用是否與補(bǔ)骨脂酚調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞中雌性激素分泌有關(guān)仍有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of bakuchiol on secretion of testosterone and estradiol from H295R cells in human with carcinoma of adrenal cortex

MAO Hao-ping1,NIU Zi-chang2,WANG Xing-ye1,QIU Yan-rong1
（1.Institute of Traditional Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

[Objective]To study the effects of bakuchiol on testosterone and estradiol secretion from H295R cells.[Methods]The researches were divided into control group and bakuchiol groups.The effects of bakuchiol on cellular activites and the secretion of testosterone and estradiol were detected by CCK-8 method and ELISA method.The levels of CYP17A1 and CYP19A1 mRNA were also detected by Real-time PCR.[Results]Bakuchiol could not affect CYP17A1 mRNA leverl but could up-regulate CYP19A1 mRNA.Bakuchiol had the effect of decreasing the secretion of testosterone but increasing the secretion of estradiol.[Conclusion]Bakuchiol can stimulate estradiol secretion from H295R cells.

bakuchiol；H295R cell；testosterone；estradiol

R285.5

：A

：1673－9043（2014）06－0347-04

2014-07-10）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81303247）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20121210120009）。

毛浩萍（1983-），女，助理研究員，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

牛子長(zhǎng)，E-mail:haoping_mao@126.com。