林 琳，許銀姬，吳 蕾，陳芝喜，于旭華

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405）

·實(shí)驗(yàn)研究·

健脾益肺Ⅱ號對熏煙聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)大鼠炎癥因子及金屬蛋白酶表達(dá)的影響*

林 琳1，許銀姬1，吳 蕾1，陳芝喜2，于旭華1

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405）

[目的]通過觀察健脾益肺Ⅱ號對熏煙聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肺組織基質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、金屬蛋白酶－9（MMP-9）和組織金屬蛋白酶抑制因子－1（TIMP－1）以及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素（IL-8）表達(dá)的影響，以探討健脾益肺Ⅱ號協(xié)調(diào)氣道損傷、修復(fù)平衡以及減少氣道重構(gòu)的作用機(jī)制，從而闡明該方防治慢性阻塞性肺疾病（COPD）氣道損傷的可能作用機(jī)制。[方法]將SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、健脾益肺Ⅱ號低劑量組、健脾益肺Ⅱ號高劑量組、潑尼松組。以熏煙聯(lián)合脂多糖(LPS)的方法建立大鼠肺部損傷模型，給予相應(yīng)藥物干預(yù)，觀察記錄大鼠一般狀況，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，采用免疫組化法比較各組大鼠肺組織MMP-9、TIMP－1的表達(dá)水平，采用ELISA法檢測大鼠肺組織及血清中TGF-β1的水平變化以及肺組織中TNF-α和IL-8水平的變化。[結(jié)果]模型組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1以及MMP-9/TIMP-1的相對表達(dá)明顯高于正常對照組（P＜0.05或P＜0.01）；健脾益肺Ⅱ號高劑量組和潑尼松組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1以及MMP-9/TIMP-1的相對表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）；模型組大鼠肺組織及血液中TNF-α、IL-8、TGF-β1含量均比正常對照組顯著升高(P＜0.01)，各給藥組經(jīng)過藥物的干預(yù)后，其含量明顯降低（P＜0.01或P＜0.05）。[結(jié)論]健脾益肺Ⅱ號方可通過降低模型動(dòng)物肺組織MMP-9/ TIMP-1相對表達(dá)量，下調(diào)血清中TGF-β1的水平，降低肺組織中TGF-β、TNF-α和IL-8的釋放水平，減少肺組織反復(fù)的損傷與修復(fù)過程，從而起到減緩氣道重構(gòu)的作用。

健脾益肺Ⅱ號；基質(zhì)金屬蛋白酶；炎癥因子；大鼠

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系統(tǒng)的常見病，與肺部對有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。近年來研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)參與肺組織細(xì)胞外基質(zhì)破壞，在COPD的形成、發(fā)展、炎癥持續(xù)方面起了重要作用，而蛋白酶/抗蛋白酶失衡是其主要發(fā)病因素[1]。健脾益肺Ⅱ號是本院的協(xié)定處方，前期臨床試驗(yàn)表明，健脾益肺Ⅱ號可緩解患者臨床癥狀，改善患者生存質(zhì)量[2]。本實(shí)驗(yàn)通過研究觀察健脾益肺Ⅱ號方對熏煙聯(lián)合脂多糖LPS誘導(dǎo)的大鼠肺組織金屬蛋白酶－9（MMP-9）和組織金屬蛋白酶抑制因子－1（TIMP－1）以及轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1），腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）表達(dá)的影響，以探討健脾益肺Ⅱ號方對于肺組織損傷修復(fù)的影響，為健脾益肺Ⅱ號方防治COPD提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級8周齡雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號：SCXK（粵）2008-0002。

1.2 藥物的配制 健脾益肺Ⅱ號方：由黨參、白術(shù)、鎖陽等組成（均購自康美藥業(yè)、江中中藥飲片有限公司，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院中藥制劑實(shí)驗(yàn)室鑒定），用回流提取法，經(jīng)兩次提取藥液并收集揮發(fā)油，濃縮至相當(dāng)于藥液含生藥2.25 g/mL，裝入塑料瓶中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑 脂多糖（Sigma）；潑尼松片（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；大前門牌過濾嘴香煙（煙堿含量0.8 mg，焦油量11 mg/支，一氧化碳含量13 mg/支，上海煙草集團(tuán)）；MMP－9和TIMP－1試劑盒（武漢博士德）；TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒（科潤達(dá)生物）；IL-8、TNF-α放免試劑盒（北京華埠力特生物）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 自制熏煙染毒箱:長×寬×高:60 cm×50 cm×50 cm；石蠟切片機(jī)：日本PIKA型；防脫玻片：博士德生物工程有限公司；L2000A型顯微鏡，廣州光學(xué)儀器廠；PE-1420多功能微孔板分析儀。

1.5 COPD模型復(fù)制 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠隨機(jī)分為4組，即:正常對照組、模型組、健脾益肺Ⅱ號高劑量組、健脾益肺Ⅱ號低劑量組、潑尼松組，每組各12只。采用熏煙加LPS氣道滴注法制作大鼠COPD模型。正常對照組，在實(shí)驗(yàn)開始的第1天和第14天經(jīng)大鼠氣管內(nèi)注入生理鹽水0.2 mL/只;第2～13天、第15～30天每天用生理鹽水10 mL/g灌胃。模型組于第1天和第14天經(jīng)大鼠氣管內(nèi)注入LPS 0.2 mL（200 μg）的生理鹽水溶液，氣道注入當(dāng)天不熏煙，第2～13天、15～30天將大鼠放入自制熏煙染毒箱中熏煙，每次給予8～10支香煙，熏煙30 min，每天2次，2次熏煙間隔時(shí)間大于4 h，熏煙完畢將動(dòng)物放回原飼養(yǎng)籠中正常進(jìn)食進(jìn)水，每天上午熏煙前用生理鹽水10 mL/kg灌胃。健脾益肺Ⅱ號組、潑尼松組的造模方法同模型組，于每天上午熏香煙前用健脾益肺Ⅱ號高、低劑量煎液、潑尼松10 mL/kg灌胃。給藥劑量為22.5 g/kg、11.25 mg/kg、2.5 mg/kg，連續(xù)4周。

2 方法

2.1 MMP－9和TIMP－1的檢測 每組隨機(jī)取3只動(dòng)物做免疫組化檢測。均采用免疫組織化學(xué)過氧化酶標(biāo)記的鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法（SP）測定，一抗為2∶100 MMP-9和TIMP-1多克隆抗體,二抗為生物素山羊抗兔IgG,陰性對照標(biāo)本用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗進(jìn)行染色。采用Image-Pro Plus5.1軟件對MMP-9和TIMP-1表達(dá)進(jìn)行圖像分析,陽性反應(yīng)為胞漿中出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性表達(dá)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽性面積率，表達(dá)強(qiáng)度用陽性面積率表示。

2.2 血清TGF-β1水平的檢測 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眼球取血，放在室溫靜置8 h，待紅細(xì)胞與血清分離，取上層淡黃色血清，置于-80℃冰箱待測。TGF-β1的具體檢測方法根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作。

2.3 肺組織TGF-β1，IL-8，TNF-α的檢測 取400mg肺組織，加入生理鹽水2 mL，用組織勻漿器充分研磨，4 000 r/min離心20 min，取上清存放-80℃冰箱備用。采用ELISA法檢測TGF-β1的含量，采用放射免疫分析法測量各組動(dòng)物肺組織勻漿液中TNF-α、IL-8含量的變化，嚴(yán)格按試劑盒說明書要求并由專人進(jìn)行操作，所有樣品1次完成實(shí)驗(yàn)。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較，采用LSD檢驗(yàn)，若方差不齊，則采用Dunnet t3檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組動(dòng)物的一般狀態(tài)觀察 正常對照組大鼠實(shí)驗(yàn)前后無明顯氣促，飲食正常，體質(zhì)量增長較快。模型組大鼠隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)行飲食減少，體質(zhì)量增長較慢，喘促和呼吸困難逐漸出現(xiàn)，并出現(xiàn)精神萎靡，少活動(dòng)，咳嗽、口鼻分泌物增多，皮毛無光澤且脫毛。而各用藥組大鼠隨著藥物的應(yīng)用，以上各種癥狀程度呈現(xiàn)較輕。

3.2 MMP-9和TIMP-1表達(dá) 模型組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1以及MMP-9/TIMP-1的相對表達(dá)明顯高于正常對照組（P＜0.05或P＜0.01）。健脾益肺Ⅱ號高劑量組和潑尼松組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1以及MMP-9/TIMP-1的相對表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），見表1、圖1-2。

表1 各組動(dòng)物肺組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)陽性面積率比較（±s） %

表1 各組動(dòng)物肺組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)陽性面積率比較（±s） %

注:與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 視野數(shù) MMP-9 TIMP-1 MMP-9/ TIMP-1正常對照組 15 0.16±0.14 0.47±0.32 0.37±0.26模型組 15 1.13±0.78**1.65±1.33*1.37±1.26*潑尼松組 15 0.27±0.15##1.01±0.53#0.25±0.19#健脾益肺Ⅱ號低劑量組 15 0.74±0.44 1.17±1.24 0.99±0.88健脾益肺Ⅱ號高劑量組 15 0.26±0.16##0.81±0.56#0.52±0.55#

3.3 血清和血漿中TGF-β1的水平檢測 與正常對照組相比，模型組血清中TGF-β1水平較高（P＜0.01）；與模型組相比，潑尼松組和健脾益肺Ⅱ號低、高劑量組血清TGF-β1水平均明顯降低（P＜0.05）。各組肺組織中TGF-β1水平相比較，模型組TGF-β1水平較正常組明顯升高（P＜0.01），健脾益肺Ⅱ號組以及潑尼松組均可顯著降低模型大鼠肺組織中TGF-β1水平（P＜0.01）。見表2。

圖2 各組大鼠肺組織TIMP-1表達(dá)比較（×400）

表2 TGF-β1水平的檢測（±s）

表2 TGF-β1水平的檢測（±s）

注：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05,##P＜0.01。

組別 n 血清TGF-β1 組織TGF-β1（pg/mL） （ng/g）正常對照組 12 21.78±5.90 17.98±5.47模型組 12 30.29±7.72** 24.94±6.93**潑尼松組 12 26.72±6.71#14.83±5.97##健脾益肺Ⅱ號低劑量組 12 27.41±8.48#16.26±4.32##健脾益肺Ⅱ號高劑量組 12 26.23±5.58#15.15±5.59##

3.4 模型組大鼠肺組織勻漿液中的TNF-α、IL-8含量均比正常對照組顯著升高（P＜0.01）。各給藥組經(jīng)過藥物的干預(yù)后，肺組織中的TNF-α、IL-8的含量明顯降低（P＜0.01）。見表3。

表3 各組動(dòng)物肺組織勻漿液中細(xì)胞因子水平的比較（±s） ng/g

表3 各組動(dòng)物肺組織勻漿液中細(xì)胞因子水平的比較（±s） ng/g

注：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n TNF-α IL-8正常對照組 12 14.02±2.13 1.30±0.19模型組 12 18.18±2.4** 1.74±0.23**潑尼松組 12 12.26±0.99##1.23±0.14#健脾益肺Ⅱ號低劑量組 12 13.21±2.27##1.28±0.11#健脾益肺Ⅱ號高劑量組 12 13.14±0.60##1.19±0.19#

4 討論

MMP是近年來發(fā)現(xiàn)的一組由鋅、鈣離子依賴性，結(jié)構(gòu)相似的基質(zhì)降解蛋白酶組成的蛋白酶家族，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）作用，MMP增多將導(dǎo)致蛋白酶過度水解，細(xì)胞外基質(zhì)形成肺泡腔擴(kuò)大，使肺組織失去彈力。金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）具有抑制MMP活性的功能。MMP的增多及MMP與TIMP之間的不平衡促進(jìn)了炎癥應(yīng)答對肺組織的損傷。目前認(rèn)為MMP-9和TIMP-1的動(dòng)態(tài)平衡是反應(yīng)氣道及肺組織破壞與修復(fù)的標(biāo)志[3-4]。有實(shí)驗(yàn)表明，COPD患者血清中MMP-9、TIMP-1濃度與第1秒用力呼氣容積占肺活量百分比（FEV1/FVC%）呈明顯負(fù)相關(guān)，而MMP-9/TIMP-1比率與FEV1占預(yù)計(jì)值百分比及FEV1/FVC%呈明顯負(fù)相關(guān)[5]。

而TGF-β1是由單核細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明，TGF-β1與氣道損傷修復(fù)的關(guān)系密切。肺氣腫時(shí)肺組織中的TGF-β1呈高表達(dá)，并且TGF-β1表達(dá)增多可能抑制呼吸道平滑肌增殖和遷移功能[6]。Gao等[7]研究表明，TGF-β/smad通路與MMP-9共同參與肺氣腫的發(fā)生，兩者相互作用可導(dǎo)致蛋白的水解和組織的損傷、纖維化的產(chǎn)生。TNF-α和IL-8是COPD大鼠氣道分泌的特征性炎癥因子[8]，TGF-β1可能介導(dǎo)了組織炎癥反應(yīng)[9]，同時(shí)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）也對TGF-β1信號通路及MMP9的表達(dá)構(gòu)成影響[10]。

中醫(yī)認(rèn)為COPD的病理機(jī)制為肺、脾、腎3臟虛損，且兼有伏痰和瘀血。針對伏痰，培土生金法被認(rèn)為是治療COPD的重要法則之一[11]。而瘀血，現(xiàn)代研究認(rèn)為與肺纖維化關(guān)系密切[12]?；钛龇ㄔ谂R床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均已被證明具有減少肺纖維化的作用[13-14]。由于肺纖維化長于COPD并見[15]，因此健脾益肺Ⅱ號以健脾益氣中藥為君臣藥，佐以活血化瘀藥物，以更好治療COPD肺纖維化。本實(shí)驗(yàn)證明，健脾益肺Ⅱ號高劑量組可減少模型大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1的表達(dá)，并且可明顯降低MMP-9/ TIMP-1的相對表達(dá)量，同時(shí)健脾益肺Ⅱ號可降低模型動(dòng)物血清或肺組織中TGF-β1、IL-8和TNF-α的水平，說明健脾益肺Ⅱ號通過以上機(jī)制改善ECM的降解和沉積失衡，減少肺纖維化的發(fā)生，減輕肺組織及呼吸道的損傷，使COPD的發(fā)展趨勢得到延緩，從而發(fā)揮其健脾益氣，化痰活血，固腎平喘之作用，這與臨床研究證明該方對COPD穩(wěn)定期有良好的治療作用相符合，為健脾益肺Ⅱ號方的臨床應(yīng)用提供了充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Influence of Jianpi Yifei II decoction on inflammatory cytokines and metalloproteases in lung tissues of rats induced by cigarette smoke and LPS

LIN Lin1,XU Yin-ji1,WU Lei1,CHEN Zhi-xi2,YU Xu-hua1
（1.The second Affliliated Hospital of Guangzhou University of Tradittonal Chinese Medicine,Guangzhou 510120, China;2.Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405）

[Objective]To investigate the influence of Jianpi Yifei II on inflammatory cytokines and and metalloproteases in lung tissues of rats induced by cigarette smoke combined LPS and to provide theoretical basis to doctors for clinical application.[Methods]The rat model of lung injury was established by using intratracheal injection of LPS combining cigarette smoke.All rats were randomly divided into normal group,model group,Jianpi Yifei II low does group,Jianpi Yifei high does group and prednisone group.General condition of rats was observed and recorded first,then we detected the expression of MMP-9 and TIMP-1 and contents of TGF-β1，TNF-α and IL-8 in lung tissue homogenate or plasma by special assay kits.[Results]After inducing lung injury by treating rats with LPS and cigarette smoke,the general condition of rats in Jianpi Yifei II group and prednisone group was better than in model group.And the ratio of MMP-9/TIMP-1 was lower in the Jianpi Yifei Group and prednisone group than in model group（P＜0.05 or P＜0.01）.In addition,compared to model group,the levels of TNF-α，IL-8 and TGF-β1 in lung tissues or plasma were significantly decreased in Jianpi Yifei II group and prednisone group（P＜0.05 or P＜0.01）.[Conclusion]Jianpi Yifei II could protect lung tissue from the cigarette smoke and LPS by regulating levels of inflammatory cytokines and MMP-9/TIMP-1 ratio.

Jianpi Yifei II;metalloprotease;inflammatory cytokines;rat

R285.5

：A

：1673－9043（2014）06－0342-05

2014-08-14）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.07

國家自然科學(xué)基金（81373566）；廣東省科學(xué)技術(shù)廳—廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院聯(lián)合科研專項(xiàng)（2011B03220 0007）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B061300074）；廣東省科技廳（2012B031800192）；廣東省中醫(yī)院朝陽人才專項(xiàng)（2014）。

林 琳（1965-），女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槁宰枞苑渭膊?、慢性咳嗽及呼吸道感染性疾病的中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合研究工作。