竇 婷，歐陽慧子，王興蕊，薄 芳，何 俊

（1.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

·中藥研究·

HPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中麻黃堿、偽麻黃堿濃度及藥動學研究*

竇 婷1，歐陽慧子2，王興蕊1，薄 芳1，何 俊1

（1.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

[目的]建立同時檢測大鼠血漿中麻黃堿、偽麻黃堿的高效液相色譜-質譜聯(lián)用法（HPLC-MS/MS），并對大鼠口服三拗湯后的麻黃堿、偽麻黃堿進行藥代動力學研究。[方法]血漿樣品經(jīng)堿化和乙酸乙酯液-液萃取，以鹽酸苯丙醇胺為內(nèi)標，乙腈-0.1%甲酸水（4∶96）為流動相，經(jīng)Agilent Zorbax SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）分離，采用電噴霧離子源（ESI），以多反應監(jiān)測（MRM）模式進行正離子檢測，定量分析的離子反應分別為：m/z 166.2→m/z 148.2（麻黃堿），m/z 166.2→m/z 148.2（偽麻黃堿）和m/z 152.1→m/z 134.1（鹽酸苯丙醇胺）。[結果]麻黃堿和偽麻黃堿血藥濃度在20～10 000 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好，批內(nèi)、批間精密度RSD均小于5.3%，高、中、低3種濃度平均方法回收率大于64.7%。[結論]該方法專屬、快速、靈敏，可用于麻黃堿、偽麻黃堿的藥代動力學研究。

麻黃堿；偽麻黃堿；藥代動力學；三拗湯；液相色譜-質譜聯(lián)用

三拗湯出自《太平惠民和劑局方》，由麻黃、杏仁和甘草3味藥物組方，臨床用于感冒風寒、咳嗽氣喘[1-2]、痰多胸悶、頭痛鼻塞等證。方中以麻黃為君，具有解表宣肺散寒的作用[3-5]。麻黃的成分主要含多種生物堿和少量揮發(fā)油，其中生物堿類以麻黃堿與偽麻黃堿為主。近年來關于麻黃堿與偽麻黃堿的含量測定方法多為毛細管電泳法[6-10]、高效液相色譜法[11-15]、氣相色譜法和氣-質聯(lián)用方法[16-18]。毛細管電泳法穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差[19]；高效液相色譜法靈敏度低；氣相色譜法和氣-質聯(lián)用方法樣品需要衍生化，較復雜。本文建立了同時測定大鼠血漿中麻黃堿、偽麻黃堿血藥濃度的高效液相色譜-質譜聯(lián)用法（HPLC-MS/MS），并將此方法應用于大鼠灌服三拗湯后麻黃堿和偽麻黃堿的藥代動力學研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 API 3200型串聯(lián)三重四級桿質譜儀（美國AB公司），配備電噴霧離子源；Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），Analyst Software數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國AB公司），梅特勒-托利多AX 205分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），超純水系統(tǒng)（Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑 鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸苯丙醇胺均購自中國藥品生物制品檢定所，乙腈（Fisher Scientific）、甲醇（TEDIA）、甲酸（天津市光復化工研究所）均為色譜純，碳酸鈉（天津化學試劑一廠）、乙酸乙酯（天津凱信化學工業(yè)有限公司）均為分析純，水為Millipore超純水。

1.3 實驗動物 SD大鼠，雄性，體質量200～230 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（合格證編號0163041）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），保護柱：Agilent Zorbax C18柱（4.6 mm×12.5 mm，5 μm），流動相：乙腈－0.1%甲酸水（4∶96），流速：0.4 mL/min，柱溫：25℃。

2.2 質譜條件 離子源為ESI源；簾氣Curtain Gas為15 psi；碰撞氣Collision Gas為5 psi；源噴射電壓Ion Spray Voltage為4 500 V；霧化器GS1為40 psi、加熱器GS2為60psi；正離子方式檢測，掃描方式為多反應離子監(jiān)測；定量分析時的離子反應分別為m/z 166.2→m/z 148.2（麻黃堿），m/z 166.2→m/z 148.2（偽麻黃堿）和m/z 152.1→m/z 134.1（鹽酸苯丙醇胺）。

2.3 溶液的制備

2.3.1 標準溶液的制備 精密稱取麻黃堿、偽麻黃堿各10 mg分別置于25 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得儲備液。量取一定量的麻黃堿、偽麻黃堿儲備液混合，用純水稀釋為10 mg/L的工作液，-20℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 內(nèi)標溶液的制備 精密稱取鹽酸苯丙醇胺標準品10 mg，置于25 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得儲備液。量取一定量的鹽酸苯丙醇胺儲備液，用純水稀釋500 ng/mL的工作液，-20℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 供試品溶液的制備 取麻黃9 g，苦杏仁9 g，甘草9g，加水220mL，煎煮60min，濾出藥液，再加水160 mL，煎煮60 min，合并藥液，于-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血漿樣品預處理 精密吸取血漿樣品100 μL，加入純水100 μL，500 μg/L內(nèi)標溶液100 μL，0.1mol/L碳酸鈉溶液100 μL，渦旋30 s，再加入乙酸乙酯800 μL，渦旋2 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液650 μL，40℃水浴氮氣吹干，100 μL甲醇復溶，超聲1 min，13 000 r/min離心5 min，取上清液10 μL進行HPLCMS/MS分析。

2.5 方法學考察

2.5.1 方法專屬性 取大鼠的空白血漿100 μL，按“2.4”項下方法操作，獲得大鼠空白血漿樣品色譜圖1A；將一定濃度的混合對照品溶液和內(nèi)標溶液加入至空白血漿中，依同法操作，得色譜圖1B；取大鼠給藥后的血漿樣品，同法操作，得色譜圖1C。其中麻黃堿、偽麻黃堿和內(nèi)標鹽酸苯丙醇胺的保留時間分別為6.04、6.85、3.88 min。結果表明，血漿中內(nèi)源性成分不干擾麻黃堿、偽麻黃堿和內(nèi)標的測定，結果見圖1。

圖1 麻黃堿、偽麻黃堿和鹽酸苯丙醇胺HPLC-MS/MS譜圖

2.5.2 標準曲線、線性范圍及定量限 取大鼠空白血漿100 μL，精密加入不同量的混合工作液，配制麻黃堿、偽麻黃堿終濃度為10 000、5 000、1 000、500、100、50、20 μg/L的血漿樣品，按“2.4”項下進行處理與測定，記錄待測物峰面積和內(nèi)標峰面積，利用待測物峰面積和內(nèi)標峰面積比對樣品血藥濃度進行線性回歸，用加權（1/X2）最小二乘法進行回歸運算,得麻黃堿的線性回歸方程為Y=0.001 46X+0.113，r=0.993 4，偽麻黃堿的線性回歸方程為Y= 0.001 73X+0.048 7，r=0.992 9，麻黃堿和偽麻黃堿的線性范圍均為20～10 000 μg/L，以S/N≥10為最低定量限，S/N≥3為最低檢測限，測得麻黃堿、偽麻黃堿最低定量限為10 μg/L，最低檢測限為1 μg/L。

2.5.3 基質效應 取大鼠空白血漿，按“2.4”項下進行處理得空白基質殘渣，精密加入一定濃度的麻黃堿、偽麻黃堿工作液，配制成各待測物終濃度分別為50、1 000、10 000 μg/L的血漿樣品，測定各待測物峰面積（A1）。另取上述等量的3個濃度的麻黃堿、偽麻黃堿工作液與水配制成各待測物終濃度為50、1 000、10 000 μg/mL的對照樣品，同法操作，測得各待測物峰面積(A0)，每個濃度平行操作3份。按基質效應=A1/A0計算，得麻黃堿、偽麻黃堿低、中、高3個濃度的基質效應介于95.6%～102.1%，內(nèi)標基質效應為98.3%，RSD值為4.2%。表明本方法可有效地避免大鼠血漿中的基質效應。

2.5.4 精密度和回收率實驗 取大鼠空白血漿，精密加入一定濃度的麻黃堿、偽麻黃堿工作液，配制麻黃堿、偽麻黃堿的終濃度分別為50、1 000、10 000 μg/L的低、中、高質控樣品，按“2.4”項下處理與測定，測得麻黃堿、偽麻黃堿峰面積（Ae）。取上述3個濃度的麻黃堿、偽麻黃堿混合對照品溶液未經(jīng)提取直接進樣測定，測得麻黃堿、偽麻黃堿峰面積（Ac），每個濃度平行操作5份，按Ae/Ac計算回收率，回收率介于64.7%～76.4%；每個濃度平行操作5份，連續(xù)測定3 d，計算批內(nèi)、批間的精密度,得精密度RSD值小于5.3%。結果見表1。

2.5.5 穩(wěn)定性考察 取空白血漿100 μL，精密加入一定濃度的麻黃堿、偽麻黃堿工作液，配制成各待測物終濃度分別為50、1 000、10 000 ng/mL的血漿樣品，分別考察其在室溫放置0、12、24 h，-20℃冷凍0、3、7 d和反復凍融3次的穩(wěn)定性。將測定的峰面積比代入標準曲線，計算質控樣品血漿實測值之間的相對差異，在上述條件下麻黃堿穩(wěn)定性RSD值0.6%～6.4%；偽麻黃堿穩(wěn)定性RSD值1.3%～5.9%，結果表明，麻黃堿和偽麻黃堿在室溫放置、長期冷凍和凍融循環(huán)條件下均穩(wěn)定。

表1 麻黃堿和偽麻黃堿在大鼠血漿中的回收率及精密度(±s，n=5)

表1 麻黃堿和偽麻黃堿在大鼠血漿中的回收率及精密度(±s，n=5)

回收率測定值（%）RSD（%） RSD（%） RSD（%）麻黃堿 50 74.6±2.22 3.3 4.0 4.7 1 000 76.4±2.07 3.0 2.1 2.2 10 000 71.7±2.69 2.6 1.0 4.7偽麻黃堿 50 64.7±2.01 3.5 3.7 4.1 1 000 69.5±3.31 5.3 0.7 3.3 10 000 69.8±3.19 5.2 2.9 3.2藥物名稱 質量濃度（μg/L）日間精密度日內(nèi)精密度

2.6 藥動學研究 雄性SD大鼠8只，體質量200～ 230 g，禁食12 h，自由飲水。將供試品溶液按9 mL/kg灌胃給藥，分別于給藥前及給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h經(jīng)眼球后靜脈叢取血0.3 mL，置于經(jīng)肝素處理的干燥離心管中，4 000 r/min離心10 min，取血漿0.1 mL用于處理、分析，測得麻黃堿、偽麻黃堿平均血藥濃度-時間曲線，見圖2。采用DAS軟件進行房室模型擬合，結果表明各組中麻黃堿、偽麻黃堿在大鼠體內(nèi)呈一室模型，同時計算大鼠單次口服三拗湯后麻黃堿、偽麻黃堿的主要藥動學參數(shù)，結果見表2。

3 討論

圖2 大鼠單次灌服三拗湯后麻黃堿、偽麻黃堿血藥濃度-時間曲線圖(n=8)

麻黃堿和偽麻黃堿互為旋光異構體，為確保較好的分離效果且不受血漿中內(nèi)源性物質的干擾，實驗以乙腈-甲酸水為流動相，考察了不同比例和pH對質譜響應的影響，最終確定流動相比例為乙腈-0.1%甲酸水（4∶96），在該色譜條件下可同時測定麻黃堿和偽麻黃堿且分離效果良好。實驗同時考察了在流動相中加入不同量的甲酸氨對質譜響應的影響，結果表明流動相中的甲酸氨對離子響應影響不大。

表2 大鼠灌服三拗湯后麻黃堿、偽麻黃堿主要藥動學參數(shù)(±s，n=8)

表2 大鼠灌服三拗湯后麻黃堿、偽麻黃堿主要藥動學參數(shù)(±s，n=8)

藥動學參數(shù) Tmax（h） Cmax（μg/L） Ke（1/h） T1/2（h）麻黃堿 2.28±1.01 1 432±332 0.14±0.03 5.16±1.43偽麻黃堿 3.06±0.94 380±122 0.18±0.06 4.26±1.62藥動學參數(shù) AUC0-tn（h·μg）/L AUC0-∞（h·μg）/L麻黃堿 14 676±4 512 15 785±5 288偽麻黃堿 2 887±1 169 3 590±1 428

通過對血漿預處理方法的考察，發(fā)現(xiàn)固相萃取法（SPE）回收率較低，成本較高，蛋白沉淀法（PPT）會產(chǎn)生嚴重的基質效應。本實驗最終采用液－液萃取法（LEE）對麻黃生物堿的血漿樣本進行處理，且對不同的萃取溶劑乙酸乙酯、乙醚、氯仿、正己烷-二氯甲烷-異丙醇等進行考察，結果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取后血漿內(nèi)源性物質對麻黃堿及偽麻黃堿的測定影響最小，且提取回收率較其他溶劑無明顯差異。同時還考察了氫氧化鈉和碳酸鈉溶液堿化血漿樣品的影響，結果發(fā)現(xiàn)用氫氧化鈉作堿化液時提取回收率不穩(wěn)定，采用最小濃度為0.1 mol/L的碳酸鈉溶液作堿化液時提取回收率較穩(wěn)定。

[1] 徐士偉.感冒后咳嗽臨證治驗[J].天津中醫(yī)藥,2011,28(2): 133-134.

[2]魏慧利,于文濤.楊牧祥教授治療支氣管哮喘的臨床經(jīng)驗[J].天津中醫(yī)藥,2011,28(2):93-94.

[3]閻麗娟,李媛媛,陳爽白.淺談麻黃的功效[J].天津中醫(yī)藥, 2011,28(4):317-319.

[4] 陳 慧.三拗湯加減治療小兒寒飲停肺型哮喘臨床觀察[J].天津中醫(yī)藥,2006,23(1):29-30.

[5]劉恩順,孫曾濤.麻芩咳喘合劑對支氣管哮喘治療效果及炎性物質的影響[J].天津中醫(yī)藥,2007,24(1):452-455.

[6]馬永鈞,李瓊琳,王偉峰,等.毛細管電泳-電致化學發(fā)光法分離測定麻黃中的麻黃堿、偽麻黃堿與甲基麻黃堿[J].分析測試學報,2012,31(2):127-132.

[7]俞勵平,王曉可,羅佳波.毛細管電泳法測定麻杏石甘湯中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和鹽酸甲基麻黃堿的含量[J].中藥材,2011,34(4):620-623.

[8]徐 靜，李 軍，胡 強，等.毛細管電泳/發(fā)光二極管誘導熒光法測定麻黃中麻黃堿偽麻黃堿含量[J].分析測試學報，2012,31(8):977-981.

[9]孫國祥，孫麗娜.毛細管區(qū)帶電泳法測定麻黃中麻黃堿和偽麻黃堿的含量[J].中南藥學,2009,7(10):773-776.

[10]丁佳佳，李征征，宋粉云.毛細管電泳法測定千柏鼻炎片中鹽酸麻黃堿%鹽酸偽麻黃堿和鹽酸甲基麻黃堿的含量[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(10):120-123.

[11]Makino Y.Simple HPLC method for detection of trace ephedrine and pseudoephedrine in high-purity methamphetamine[J].Biomed Chromatogr,2012,26(3):327-330.

[12]張志鵬,朱勝山,李苑山,等.大鼠血漿中麻黃堿偽麻黃堿含量的高效液相色譜測定[J].時珍國醫(yī)國藥,2012,23 (8):1878-1880.

[13]張建軍,歐麗娜,李 偉,等.小青龍顆粒中麻黃堿及偽麻黃堿在大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2012,25(12):1991-1995.

[14]葛 斌,羅燕梅,徐愛霞,等.HPLC測定麻黃藥材中麻黃堿與偽麻黃堿的含量[J].中華中醫(yī)藥雜志,2008,43(3): 173-175.

[15]張 俐,王 玉.高效液相色譜法測定鼻炎康片中麻黃堿和偽麻黃堿的含量[J].中南藥學,2013,10(11):761-764.

[16]賀 豐,羅佳波,陳飛龍,等.GC-MS法研究麻黃湯中麻黃堿偽麻黃堿的人體內(nèi)過程[J].中藥新藥與臨床藥理,2004, 15(5):336-347.

[17]李吉來,陳飛龍,劉傳明,等.麻黃湯中麻黃堿與偽麻黃堿的GC-MS法測定及配伍因素對湯劑中該成分含量的影響[J].中草藥,2002,33(4):21-23.

[18]趙 婕，邵 兵，孟 娟，等.氣相色譜-質譜測定保健食品中的麻黃堿和偽麻黃堿[J].色譜,2004,22(2):188.

[19]呂 霞,郭 青,鐘文英.色譜法在麻黃生物堿手性分析中的研究進展[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2011,26(3):181-187.

Simultaneous determination of ephedrine and pseudoephedrine in rat’plasma and their pharmacokinetics determined by LC-MS/MS

DOU Ting1,OUYANG Hui-zi2,WANG Xing-Rui1,BO Fang1,HE Jun1
（1.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine,Institute of Traditional Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To develop a LC-MS/MS method for the determination of ephedrine and pseudoephedrine in rat’s plasma simultaneously and to study the pharmacokinetics of ephedrine and pseudoephedrine of rat’s plasma after oral administration of SD(Sanao Decoction).[Methods]The blood plasma samples were extracted through alkali and ethyl acetate liquid-liquid.Phenylalanine hydrochloride was used as the internal standard.Separation was performed using an Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm).The analytical column was acetonitrile-0.1%formic acid in water solution(4:96).Electrospray ionization(ESI)source was applied and operated in the positive ion mode.Multiple reaction monitoring(MRM)mode with the transitions of m/z 166.2→m/z 148.2,m/z 166.2→m/z 148.2 and m/z 152.1→m/z 134.1 were used to quantify ephedrine,pseudoephedrine and phenylalanine hydrochloride,respectively.[Results]The linearity ranged from 20 to 10 000 μg/L.RSD for inter-match and intra-match were not more than 5.3%and the average extracted recovery for all the high,middle and low concentration was more than 64.7%.[Conclusion]The analytical method is proved to be special,sensitive,rapid and suitable for the pharmacokinetic study of ephedrine and pseudoephedrine.

ephedrine;pseudoephedrine;pharmacokinetic;Sanao decoction;LC-MS/MS

R285.5

：A

：1673－9043（2014）06－0355-04

2014-08-14）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.10

高等學校博士學科點專項科研基金項目（20131210 120015）；天津市高等學校科技發(fā)展基金計劃項目（20110212）。

竇 婷（1989－），女，碩士研究生，主要研究方向為藥物分析。

何 俊，E-mail:hejun673@163.com。