鄭旭銳，惠 毅，閆曙光，宋 逍，曹 寧，王禮鳳，晁 旭

（陜西中醫(yī)學院，咸陽 712046）

三甲散對HSC-T6細胞α-SMA、TIMP-1和ROCK-Ⅰ蛋白表達的影響*

鄭旭銳，惠 毅，閆曙光，宋 逍，曹 寧，王禮鳳，晁 旭

（陜西中醫(yī)學院，咸陽 712046）

[目的]檢測三甲散含藥血清對肝星狀細胞株（HSC-T6）細胞中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、基質金屬蛋白酶抑制-1（TIMP-1）和蛋白激酶（ROCK-Ⅰ）的表達，從而研究三甲散對HSC-T6細胞增殖作用的影響。[方法]以三甲散含藥血清干預HSC-T6細胞，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）和免疫印跡（Western blot）技術，檢測三甲散含藥血清對HSC-T6細胞中α-SMA、TIMP-1和ROCK-Ⅰ的蛋白表達。[結果]三甲散和Y-27632顯著地降低了HSC-T6細胞α-SMA、ROCK-Ⅰ和TIMP-1 mRNA和蛋白的表達。[結論]三甲散可降低HSC-T6細胞ROCK-Ⅰ蛋白、TIMP-1和α-SMA的表達,從而抑制HSC-T6細胞的增殖。

三甲散；α-SMA；TIMP-1；ROCK-Ⅰ；蛋白表達

肝纖維化是指肝細胞發(fā)生炎癥刺激或壞死時，各種致病因子致肝臟中細胞外基質（ECM）增生和降解之間失去應有的平衡，進而導致肝臟內纖維結締組織異常沉積、肝內彌漫性細胞外基質過度沉淀的病理過程，其進一步發(fā)展即可以導致肝硬化、肝癌。據(jù)資料統(tǒng)計，中國約有3 000萬慢性肝炎患者，其中約有20%～40%可發(fā)展為肝硬化乃至肝細胞癌[1]。肝星狀細胞（HSC）是肝臟細胞外基質的主要細胞來源，是肝纖維化形成的細胞學基礎。細胞α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）可作為HSC活化的標志?；|金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）是組織型基質金屬蛋白酶抑制因子（TIMPs）家族中作用最強的成員，為促纖維化因子[2]。Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK-Ⅰ）是由屬于小G蛋白超家族的Rho小G蛋白激活的，它可以調節(jié)肝星狀細胞的多種生物學行為，包括表型、運動、生長分裂、凋亡、基因表達等，從而激活肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。三甲散源自明代末年著名溫病學家吳又可的著作《溫疫論》，其具有融滋陰、活血、行氣、逐瘀的作用，對邪正交灼而成久病入絡的痼疾頗為適宜，近年來三甲散日益受到現(xiàn)代醫(yī)家的關注[3-7]，本研究擬從三甲散對HSC-T6細胞Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK-Ⅰ）、TIMPs和細胞α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達。初步揭示三甲散抗肝纖維化的作用機制。

1 實驗材料

三甲散藥液：由鱉甲、龜甲、穿山甲、地鱉蟲、生牡蠣、白僵蠶、白芍、當歸、甘草組成，以上藥物均購自陜西中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中藥房，藥物加水浸泡常規(guī)煎煮、過濾，水浴蒸發(fā)濃縮至每毫升含生藥3.5 g。三甲散按10 mL/kg藥液經胃灌藥，1次/d，連續(xù)灌胃7 d，最后1次灌藥（灌藥前應禁食不禁水12 h）1 h后，腹主動脈采血，離心分離血清，56℃水浴中滅活30 min，0.44 μm微孔濾膜過濾，-20℃冷藏備用。Y-27632（美國ALEXIS公司），大鼠肝星狀細胞株HSCT6（購自上海肯強儀器有限公司），反轉錄試劑盒（美國Promega公司），引物由寶生物工程（大連）有限公司設計合成，Trizol regeant（美國Invitrogen公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)方法 HSC-T6細胞接種在100 mL的培養(yǎng)瓶中（按1×105個/cm2），之后用DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素）培養(yǎng)，在飽和濕度為5%，溫度為37℃的二氧化碳（CO2）恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。根據(jù)HSC-T6細胞生長、增殖情況及時更換培養(yǎng)液（周期約為每2～3 d 1次）。

2.2 細胞傳代方法 選擇對數(shù)生長期的HSC-T6細胞，細心吸去培養(yǎng)液，再加入0.25%的胰蛋白酶，37℃消化3 min，加入DMEM[含10%胎牛血清（FBS）]培養(yǎng)液，輕輕吹打培養(yǎng)瓶的瓶壁，收集細胞懸液后離心5 min（1 000 g），棄去上清液后加入DMEM培養(yǎng)液含10%FBS重懸，之后以5×104個/cm2接種。

2.3 實驗分組 實驗分組為：空白對照組（DMEM培養(yǎng)液＋HSC-T6細胞），三甲散組（DMEM培養(yǎng)液＋HSC-T6細胞＋6 mmol/L三甲散），Y-27632陽性對照組（DMEM培養(yǎng)液＋HSC-T6細胞＋10μmol/L Y-27632）。

2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）法和免疫印跡（Western blot）法檢測α-SMA、ROCK-Ⅰ、TIMP-1mRNA和蛋白的表達 RT-PCR法按照試劑盒說明書進行，Western blot檢測時先用細胞裂解液裂解細胞后用BCA法檢測蛋白濃度，在-70℃凍存后再按試劑說明書進行。

2.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，單因素方差分析及SNK檢驗，結果用均數(shù)±標準差（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

RT-PCR結果顯示，與對照組相比，三甲散和Y-27632甙作用24 h后，HSC-T6細胞中α-SMA、ROCK-I及TIMP-1mRMA表達均降低（P＜0.01），見圖1。Westernblot結果亦顯示，與對照組相比，三甲散和Y-27632甙作用24 h后，HSC-T6細胞中α-SMA、ROCK-I及TIMP-1蛋白表達均降低（P＜0.05），見圖2、圖3。

4 討論

圖1 三甲散和Y-27632對HSC-T6細胞α-SMA、ROCK-I、TIMP-1mRMA相對表達水平

目前研究認為，HSC的激活是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)[8]，α-SMA蛋白可以作為HSC活化的標志。TIMP-1為促纖維化因子，是TIMPs家族中作用最強的成員[9]。ROCK-Ⅰ是由屬于小G蛋白超家族的Rho小G蛋白激活的，其與α-SMA、TIMP-1同為肝纖維化過程中HSC激活不可缺少的成員。近年來研究表明，Rho/ROCK信號通路參與了肝纖維化的形成過程，它可以調節(jié)HSC的多種生物學行為，從而激活HSC，形成肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，在HSC的活化中扮演了非常重要角色[10-15]。

圖2 三甲散和Y-27632對HSC-T6細胞α-SMA、ROCK-I及TIMP-1蛋白表達的影響

圖3 三甲散和Y-27632對HSC-T6細胞α-SMA、ROCK-I、TIMP-1蛋白相對表達水平

三甲散方來源于明代著名的溫病學家吳又可的著作《溫疫論》。在《溫疫論·主客交》中這樣寫道：“補之則邪火愈熾，泄之則損脾壞胃，滋之則膠邪愈固，散之則經絡益虛，疏之則精氣愈耗，守之則日消近死……所謂客邪膠固于血脈，主客交渾，最難得解，且愈久愈固，治法當乘其大肉未消，真元未敗，急用三甲散，多有得生者?！盵16]此處所說的“主”是指正氣、氣血，“客”指外來的邪氣。“主客交”的意思是指素體正氣已經虛衰，陰精耗竭非常嚴重，客邪留戀不去，正氣虛弱不能逐邪外出，客邪不得從外解，與虛竭之營血相互膠結留滯于血脈而成的一種頑固變證。與虛、瘀、毒互結，痹阻絡脈的絡病實質基本相同，因此，“主客交”的核心在于絡病陰傷，其中氣滯血瘀痰凝又是絡病的基本病理變化[17-18]。吳又可所說的三甲散是治療“主客交”的主要方劑，方中的藥物主要有鱉甲、龜甲、地鱉蟲、生牡蠣、穿山甲、白僵蠶、白芍、當歸、甘草。其中的鱉甲、龜甲中醫(yī)學認為其是屬于血肉有情之品，它們既可以驅逐陰分之邪，又可以滋養(yǎng)身體的精血；牡蠣、白僵蠶、穿山甲、地鱉蟲以入絡搜邪散結；方中的當歸、白芍、甘草主要起益氣養(yǎng)血的作用，這些藥物合用共奏軟堅散結、養(yǎng)肝通絡之功。綜觀全方具有融滋陰、行氣、活血、逐瘀的作用，對久病入絡，邪正交渾而成的痼疾非常適宜。

實驗結果發(fā)現(xiàn)，三甲散可以降低α-SMA mRMA與蛋白表達，ROCK-I、TIMP-1的mRMA與蛋白表達也均降低。其抗纖維化的作用機制很可能是通過抑制HSC-T6細胞增殖活化、降低α-SMA mRMA與蛋白表達，ROCK-I、TIMP-1的mRMA與蛋白表達來實現(xiàn)的，值得進一步的研究探討。

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Effect of Sanjia powder on expression of protein of α-SMA,TIMP-1,ROCK-Ⅰin hepatic stellate cell

ZHENG Xu-rui,HUI Yi,YAN Shu-guang,SONG Xiao,CAO Ning,WANG Li-feng,CHAO Xu
（Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Xianyang 712046,China）

[Objective]The expression of α-SMA,TIMP-1 and ROCKⅠin the hepatic（HSC-T6）stellate cell were measured to study the proliferating effect of Sanjia powder.[Methods]HSC-T6 cells interfered by Sanjia powder-containing serum,RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of α-SMA,TIMP-1,ROCKⅠin the hepatic stellate cell.[Results]Real-time PCR and Western blot assay showed that Sanjia powder and Y-27632 could reduce the expression of ROCK-Ⅰprotein,TIMP-1 and a-SMA mRNA in HSC-T6 cells.[Conclusion] Sanjia powder can decrease the expression of ROCK-Ⅰprotein,TIMP-1 and a-SMA in HSC-T6 cells.

Sanjia powder；α-SMA；TIMP-1；ROCK-Ⅰ；protein expression

R285.5

：A

：1673－9043（2014）06－0359-03

2014-08-16）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.11

陜西省科技廳資助項目（2013JQ4007）。

鄭旭銳（1976-），女，博士，主要從事中醫(yī)藥防治感染性疾病工作。