宋軍 汪文浩 單雪芹 夏新成

（廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司 廣東省畜禽健康養(yǎng)殖與環(huán)境控制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東新興 527439）

合肥市本地某養(yǎng)殖場(chǎng)雞群發(fā)生以雞只精神沉郁、機(jī)體漸漸消瘦、雞只站立不穩(wěn)及剖檢以內(nèi)臟型腫瘤癥狀為主要特征的疾病，綜合采用臨床剖檢觀察病變、病理學(xué)和分子生物學(xué)檢驗(yàn)等診斷技術(shù)，診斷為馬立克氏病感染。現(xiàn)將診斷過程報(bào)道如下。

馬立克氏病是由馬立克氏病病毒引起的重要的傳染性腫瘤病[1]，以淋巴細(xì)胞增生和腫瘤形成為特征，外周神經(jīng)、各種臟器、肌肉、虹膜和皮膚等發(fā)生單核細(xì)胞浸潤，進(jìn)而引起許多功能障礙。馬立克氏病可以導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，感染雞群生產(chǎn)性能下降，免疫應(yīng)答水平降低，容易繼發(fā)感染其他疾病，死亡率升高，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。2013年11月，安徽省合肥市某養(yǎng)殖戶110日齡左右土雞開始出現(xiàn)消瘦、癱腿等情況，每天出現(xiàn)零星死亡。該養(yǎng)殖場(chǎng)已按正常免疫程序進(jìn)行了馬立克氏病、禽流感、新城疫和傳染性支氣管炎等疫苗免疫。筆者對(duì)病死雞進(jìn)行臨床剖檢觀察，初步診斷為內(nèi)臟型腫瘤病，之后通過病理學(xué)變化和分子生物學(xué)的檢測(cè)，對(duì)該病診斷為馬立克氏病并提出相應(yīng)的處理措施。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

取發(fā)病雞只的心臟、肝臟等組織中眼觀明顯有腫瘤的部位，并置于4%中性甲醛溶液中固定。

1.2 試劑、器材及儀器

4%中性甲醛、無水乙醇、二甲苯、蘇木精染液、冰醋酸等；PrimeScriptOneStepRT-PCRKitVer.2試劑盒、MarkerDL2000等；染色缸、載玻片和蓋玻片等；冷凍切片機(jī)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱和光學(xué)顯微鏡等。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中登錄的MDV (AF147806)和MDV(JX844666.1)的基因序列，設(shè)計(jì)并合成引物用于檢測(cè)MDV。引物由上海生工公司合成。

MDV-F：5’-TACTTCCTATATAGATTGAGACGT-3’；MDV-R：5’-GAGATCCTCGTAAGGTGTAATTA-3’；目的條帶約為434bp。

1.4病理學(xué)觀察

對(duì)發(fā)病雞只進(jìn)行記錄，對(duì)病死雞只進(jìn)行臨床剖檢，記錄臨床癥狀。取心臟和肝臟發(fā)生明顯腫瘤組織于4%中性甲醛中固定，使用冷凍切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.5 PCR診斷

1.5.1 病毒RNA的提取

取病死雞肝組織和脾臟，研磨，反復(fù)凍融破碎，使用AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒抽提組織中病毒DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 PCR反應(yīng)

采取50μLPCR反應(yīng)體系。

?

PCR反應(yīng)條件如下：50℃30min，95℃3min；95℃30s，50℃40s，72℃40s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及剖檢觀察

發(fā)病雞群整體消瘦，精神沉郁，雞冠和肉髯發(fā)育不良、蒼白或萎縮；部分病雞縮頭呆立，羽毛蓬松。病程較長的雞消瘦，生長停滯，最終衰竭而亡。

剖檢發(fā)現(xiàn)氣囊都清亮，心臟和肝臟上有凸出于表面質(zhì)地堅(jiān)實(shí)的灰白色結(jié)節(jié)，肝脾腫大，肝臟表面有凸出的黃豆粒大小的灰白色結(jié)節(jié)，見圖1a和圖1b。其余癥狀不明顯。

2.2 病例組織學(xué)觀察

所取病料的病理學(xué)檢查結(jié)果見圖2。由圖2a可知，在心肌纖維間有淋巴樣瘤細(xì)胞浸潤；圖2b中的肝組織中出現(xiàn)腫瘤病灶，正常結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞，其中可見大小不等的淋巴瘤細(xì)胞浸潤，且瘤細(xì)胞多見核分裂相。

觀察本病例發(fā)現(xiàn)在心臟和肝臟中均有腫瘤病灶發(fā)生，顯微鏡下可見腫瘤細(xì)胞為多形態(tài)淋巴樣細(xì)胞，可據(jù)此區(qū)別于淋巴細(xì)胞樣白血病和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥。

2.3 分子生物學(xué)診斷

以肝臟、脾臟組織抽提的DNA為模板，進(jìn)行MDV的PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果在500bp稍下處有一條亮帶，見圖3，與預(yù)期大?。?34bp）相符合。

圖1a 肝臟腫瘤

圖1b 心臟腫瘤

圖2a 心臟腫瘤組織切片

圖2b 肝臟腫瘤組織切片

3 討論

近年來，雞的腫瘤性疾病，如雞馬立克氏病、淋巴細(xì)胞白血病和網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病均可引起腫瘤的發(fā)生，在疾病診斷過程中需要注意三者的鑒別診斷[2]。禽白血病腫瘤細(xì)胞以形態(tài)一致的成淋巴瘤細(xì)胞為主；網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病中的網(wǎng)狀細(xì)胞樣瘤細(xì)胞彌漫性或結(jié)節(jié)性增生；馬立克氏病的腫瘤細(xì)胞在組織學(xué)上有其特有形態(tài)，即大小不等、著色不均及多見核分裂項(xiàng)的淋巴樣瘤細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)通過病例組織學(xué)及病原學(xué)的檢測(cè)方法，對(duì)該養(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)病雞進(jìn)行檢測(cè)，在臨床剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟型MD的病變特征。病例組織學(xué)觀察表明腫瘤組織為大小不一、形態(tài)多樣的淋巴瘤樣細(xì)胞。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在不同的腫瘤組織中均能檢測(cè)到MDV，與上述檢測(cè)結(jié)果相吻合，表明該雞群所患疾病為MD。但此雞群注射過MD疫苗，卻又發(fā)生疾病，究竟是因?yàn)轳R立克氏病病毒毒力的不斷增強(qiáng)[3]及免疫失敗還是存在其他因素導(dǎo)致MD的發(fā)生有待進(jìn)一步的研究。

腫瘤性疾病給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的重要因素[4]。建議當(dāng)?shù)胤N雞養(yǎng)殖業(yè)者切實(shí)做好MD的疫苗免疫，提高飼養(yǎng)管理水平，并注意日常衛(wèi)生管理和消毒措施，控制并發(fā)或繼發(fā)感染，同時(shí)也需祖代種雞場(chǎng)做好垂直傳播性腫瘤病的檢疫凈化工作。

[1]Davidson.Invivoeventsofretrovirallongterminal repeatintegrationintoMarck’sdiseasevirusin commercialpoultry:detectionofchimericmoleculesasa marker[J].AvianDis,2001,45:102-121.

[2]GeerligSH，QuanZS，SuurlandB，etal.Efficacyand safetyofcellassociatedvaccinesagainstMarek′s diseasevirusgrowninacontinuouscelllinefrom chickens［J］.Vaccine，2008，26（44）：55-56.

[3]王桂英.雞馬立克氏病的診斷與防治［J］.中國畜禽種業(yè)，2010，1：133-134.

[4]曲悅，高立海.尼克珊瑚粉蛋雞馬立克氏病的病理及分子診斷［J］.中國家禽，2010，11（21）：49-50.