潘 飛，尹 航

解放軍總醫(yī)院，北京 100853 1腫瘤中心實驗室；2腫瘤內(nèi)二科

基礎(chǔ)研究

PTEN基因表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系

潘 飛1，尹 航2

解放軍總醫(yī)院，北京 1008531腫瘤中心實驗室；2腫瘤內(nèi)二科

目的探討食管鱗狀細(xì)胞癌中的PTEN蛋白表達(dá)與食管鱗癌分化、浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組化SP方法檢測PTEN蛋白在50例患者的食管鱗癌組織和其匹配的癌旁組織中的表達(dá)，并用細(xì)胞遷移和侵襲實驗證明PTEN對食管癌轉(zhuǎn)移的作用。結(jié)果PTEN蛋白在食管鱗癌中的陽性表達(dá)率為60%，癌旁正常組織的陽性表達(dá)率為90%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=4.078，P＜0.001)。PTEN的表達(dá)與腫瘤分化程度呈正相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)。過表達(dá)PTEN抑制了食管鱗癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力。結(jié)論PTEN蛋白的表達(dá)下調(diào)與食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)。

食管鱗狀細(xì)胞癌；PTEN；轉(zhuǎn)移

食管癌是危害人類健康的主要惡性腫瘤之一。在世界范圍內(nèi)，發(fā)病率居全部腫瘤第8位，腫瘤相關(guān)死亡居率居第6位[1-3]。中國是食管癌高發(fā)區(qū)，組織學(xué)上以食管鱗癌為主。腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是食管癌預(yù)后差的主要原因之一，5年生存率為5% ～ 45%[4-7]。其發(fā)病機(jī)制可能與原癌基因激活、抑癌基因失活及腫瘤轉(zhuǎn)移基因異常有關(guān)[8]。PTEN是10號染色體缺失且與張力蛋白同源物的抑癌基因，具有磷酸酶活性，與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)[9-14]。多項研究報道PTEN基因的突變或缺失參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，影響細(xì)胞周期和凋亡，甚至誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的放療抵抗性[15-18]。本研究采用免疫組織化學(xué)SP法檢測50例患者的食管鱗癌組織和其匹配的癌旁組織中的PTEN蛋白的表達(dá)水平，探討PTEN表達(dá)水平與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系，并從腫瘤細(xì)胞水平驗證PTEN對食管鱗癌的功能，以期為臨床治療提供新的證據(jù)與思路。

材料和方法

1 樣本來源 50例食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)組織標(biāo)本為本院2012年3月- 2013年10月手術(shù)切除的組織標(biāo)本。所有標(biāo)本均取自首次切除食管且術(shù)前未接受放療和化療的食管癌患者。每例標(biāo)本均取原發(fā)灶癌組織及距離癌組織1.5 cm以上的食管癌旁組織。所有標(biāo)本均在腫瘤切除后30 min內(nèi)采集，均以10%甲醛固定、脫水、石蠟包埋，制備成3 μm切片。每例常規(guī)制片3張，1張HE染色進(jìn)行組織學(xué)診斷和分類，2張做免疫組化染色?；颊叩男詣e、年齡、腫瘤分化程度、是否轉(zhuǎn)移、TNM分期等臨床特征見表1。

表1 PTEN表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between PTEN exp ression and clinicopathological characteristics in ESCC

2 試劑與儀器 兔抗人PTEN抗體購自Cell Signaling。SP試劑盒及濃縮型DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物有限公司。

3 免疫組化方法及結(jié)果判斷 免疫組化SP方法。實驗步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。采用已知的食管鱗癌陽性標(biāo)本作陽性對照，用PBS液代替一抗作陰性對照。綜合考慮切片中陽性細(xì)胞百分比和陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度兩項指標(biāo)，半定量積分法判斷結(jié)果。根據(jù)顯色程度判斷陽性強(qiáng)度：基本不著色者為0分，著色淡黃色者為1分，棕黃色者為2分，棕褐色者為3分。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取切片并平展、選取細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)清晰的視野，選取5個視野(×40)，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，計算各個視野中陽性細(xì)胞的平均百分率作為該切片陽性細(xì)胞的百分率。按陽性細(xì)胞的平均百分率計分：0分為無陽性細(xì)胞，1分為陽性細(xì)胞≤10%，2分為陽性細(xì)胞11% ～ 50%，3分為陽性細(xì)胞51% ～75%，4分為陽性細(xì)胞＞75%。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞計分乘積0 ～ 2分記為(-)，3 ～ 5分記為(+)，6 ～9分記為(++)，10 ～ 12分記為(+++)。

4 細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng) 人食管鱗癌細(xì)胞株KYSE150由本院消化科實驗室郭明洲教授惠贈。培養(yǎng)基為RPMI1640，血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素購自Hyclone公司。細(xì)胞在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外培養(yǎng)。2 ～ 3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

5 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 利用載體pcDNA3.1(+) (Invitrogen)和酶切位點KpnⅠ、XhoⅡ構(gòu)建PTEN過表達(dá)質(zhì)粒，命名為pcDNA-PTEN，對照組為pcDNA3.1。將質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)入食管鱗癌細(xì)胞株KYSE150，收集RNA和蛋白，并用Real-Time Quantitative PCR (qPCR)和Western blot來驗證PTEN的過表達(dá)。轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine 2000(Invitrogen)。

6 Transwell遷移及細(xì)胞侵襲實驗檢測過表達(dá)PTEN對食管癌轉(zhuǎn)移的抑制作用 無菌鑷子將Transwell小室(或鋪基質(zhì)膠的小室)放入24孔板的孔中；將預(yù)熱的無血清培養(yǎng)基200 μl加入到小室的上層，室溫下放置20 ～ 30 min，使ECM層充分水化；用無血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，濃度為5×106/ml；向24孔板中加入500 μl含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基；向每個小室中加入200 μl第3步制備的細(xì)胞懸液；孵箱中孵育24 ～ 72 h；用棉拭子將小室上層未侵襲的細(xì)胞輕輕擦掉；將500 μl結(jié)晶紫染色液加入24孔板未占用的孔中；然后將擦去上層細(xì)胞的小室放入染色液中，使其被染色液浸透，染色20 min；將小室浸入盛有去離子水的燒杯中，沖洗數(shù)次，空氣干燥；顯微鏡下觀察照相，10倍鏡視野下隨機(jī)選取5個視野計數(shù)細(xì)胞。

7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。組間差異分析采用配對設(shè)計的秩和檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 食管鱗癌組織標(biāo)本PTEN蛋白表達(dá)低于癌旁食管組織 50例食管鱗癌組織標(biāo)本的PTEN蛋白陽性率為60%，癌旁組織的陽性率為90%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=4.078，P＜0.001)。見表2。

表2 PTEN在食管鱗癌和癌旁組表達(dá)情況Tab. 2 Expression of PTEN in ESCC tissues and adjacent noncancerous tissues (n)

2 食管鱗癌PTEN蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 PTEN蛋白在高、中、低分化食管鱗癌中的陽性表達(dá)率分別為80%(16/20)、56.3%(9/16)、35.7%(5/14)，可知食管鱗癌組織的PTEN蛋白表達(dá)水平與食管鱗癌的分化程度呈正相關(guān)，分化程度越高陽性率越高(P=0.032)。PTEN在淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移的癌組織中陽性表達(dá)率分別為78.9%(15/19)、48.4%(15/31)，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.032)。PTEN蛋白在食管鱗癌浸潤淺層組、浸潤深層組陽性率分別為77.3%(17/22)、46.4%(13/28)，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.027)。PTEN蛋白在食管癌早期表達(dá)高于晚期(P=0.021)。另PTEN蛋白表達(dá)水平與年齡、性別無相關(guān)性。見表1。

3 食管鱗癌PTEN蛋白的過表達(dá)抑制食管鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力 我們構(gòu)建了PTEN的過表達(dá)質(zhì)粒。將質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)入食管鱗癌細(xì)胞株KYSE150，48 h后收集RNA和蛋白，通過qPCR和Western blot檢測，結(jié)果表明PTEN在KYSE150細(xì)胞中實現(xiàn)了過表達(dá)(圖1)。Tanswell遷移實驗顯示PTEN過表達(dá)組(pcDNA-PTEN)癌細(xì)胞遷移穿過小孔的數(shù)目比對照組(pcDNA3.1)少了近60%(圖2A)，過表達(dá)PTEN抑制了癌細(xì)胞的遷移能力(P＜0.05)。細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果表明PTEN過表達(dá)組(pcDNAPTEN)癌細(xì)胞穿過小孔的數(shù)目比對照組(pcDNA3.1)少了近65%(圖2B)，過表達(dá)PTEN抑制了癌細(xì)胞的侵襲能力(P＜0.05)。

圖 1 成功構(gòu)建PTEN過表達(dá)質(zhì)粒Fig. 1 Overexpression of PTEN was successfully constructed

圖 2 PTEN的高表達(dá)可以抑制食管鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力 A： 遷移實驗； B： 侵襲實驗Fig. 2 Overexpression of PTEN rem arkably inh ibited the ability of m igration (A) and invasion (B) in ESCC cells (a P＜0.05, b P＜0.05)

討 論

PTEN基因是1997年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，位于染色體10q23上，全長210 kb，編碼含403個氨基酸的蛋白質(zhì)[19]。PTEN具有特異的磷酸酶活性，可調(diào)節(jié)3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)和3，4-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水平，影響Akt通路，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖分化和凋亡，發(fā)揮腫瘤抑制作用[20]。也有研究證明，PTEN通過下調(diào)局灶黏附激酶的表達(dá)，抑制胃癌的轉(zhuǎn)移和浸潤[12]。

PTEN廣泛表達(dá)于上皮細(xì)胞，主要通過基因的突變、缺失或甲基化而失活，表現(xiàn)為PTEN mRNA或蛋白的不表達(dá)或表達(dá)下調(diào)[21-22]。食管鱗癌是上皮來源的腫瘤。本研究結(jié)果顯示食管鱗癌組織中的PTEN蛋白陽性表達(dá)率低于相應(yīng)的癌旁組織。這表明抑癌基因PTEN的表達(dá)下調(diào)在食管癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的作用。我們進(jìn)一步探討了PTEN的表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)：1)PTEN蛋白表達(dá)水平與食管鱗癌分化程度呈正相關(guān)，分化程度越低，腫瘤惡性程度越高，陽性率越低；2)PTEN蛋白表達(dá)水平與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；3)PTEN蛋白表達(dá)水平與食管鱗癌浸潤程度呈負(fù)相關(guān)，浸潤深層組PTEN陽性率低于浸潤淺層組；4)PTEN蛋白表達(dá)水平與臨床TNM分期呈負(fù)相關(guān)，Ⅰ～Ⅱ期的PTEN陽性率高于Ⅲ～Ⅳ期的陽性率，提示PTEN的表達(dá)缺失或下調(diào)主要發(fā)生在食管鱗癌的晚期。

以上結(jié)果表明，PTEN蛋白表達(dá)與食管鱗癌的惡性程度、浸潤深度、轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，這與PTEN在其他腫瘤中的作用相似[16-17]。為此，我們通過細(xì)胞水平上的遷移和侵襲實驗證明PTEN過表達(dá)組的癌細(xì)胞穿過小孔的數(shù)目均少于對照組，提示PTEN的高表達(dá)可以抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，PTEN蛋白在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用，可以調(diào)控食管鱗癌的浸潤、轉(zhuǎn)移。對食管癌的PTEN基因研究，有助于進(jìn)一步闡明食管癌的發(fā)生機(jī)制，為腫瘤的診斷、治療、預(yù)后評估提供新的思路。

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Relationship between expression of PTEN and infiltration and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma

PAN Fei1, YIN Hang2
1Key Laboratory of Oncology;2Department of Oncology Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
The frst author: PAN Fei． Email: panfeisysu@126．com; YIN Hang． Email: story2001@126．com

ObjectiveTo investigate the relationship between protein expression of PTEN and differentiation, infiltration and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC)．MethodsThe immunohistochem isty SP method was used to detect the protein expression of PTEN in 50 cases of ESCC tissues and adjacent noncancerous tissues． Then, cell biological experiments such as migration and invasion experiments were performed in ESCC cell lines to explore their functions in tumor progression．ResultsThe positive incidence of PTEN in ESCC tissues was 60%, while in adjacent noncancerous tissues, it was 90%． The differences were statistically signif cant (Z=4．078, P＜0．001)． The protein expression of PTEN was positively correlated with its differentiation．Furthermore, the protein expression of PTEN had a negative correlation with lymph node metastasis，depth of invasion and TNM．Correspondingly, overexpression of PTEN remarkably inhibited the ability of m igration and invasion in ESCC cells．ConclusionThe decreased protein expression of PTEN plays an important role in the metastasis of ESCC．

esophageal squamous cell carcinoma; PTEN; metastasis

R 735.1

A

2095-5227(2014)08-0843-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.08.019

2014-06-05 10:35

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140605.1035.002.html

2014-05-05

國家自然科學(xué)基金項目(81301781)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81301781)

潘飛，男，在讀碩士。研究方向：消化系統(tǒng)腫瘤。Email: panfeisysu@126.com；共同第一作者：尹航，男，主治醫(yī)師。研究方向：肺癌和消化系統(tǒng)腫瘤。Email: story2001@126.com