張培海李廣森潘俊杰張科莊俞旭君尤耀東吳天浪常德貴*

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)（成都 610072）; 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿男科; 3.四川眉山市中醫(yī)院泌尿科

4.中國(guó)人民解放軍第 71中心醫(yī)院泌尿科; 5.成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院男科

肝郁證SD大鼠睪酮及間質(zhì)細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)研究

張培海1,2李廣森1潘俊杰3張科莊4俞旭君5尤耀東1吳天浪1常德貴5*

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)（成都 610072）; 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿男科; 3.四川眉山市中醫(yī)院泌尿科

4.中國(guó)人民解放軍第 71中心醫(yī)院泌尿科; 5.成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院男科

目的研究肝郁證SD大鼠血清睪酮（testosterone，T）及間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cell）的水平。方法 取6月齡SD雄性大鼠18只，隨機(jī)分成兩組：模型組12只，空白組6只?？瞻捉M常規(guī)飼養(yǎng)，模型組采用自制枷鎖套在大鼠頸部，并用自制的腳鐐束縛其雙后足，連續(xù)21d，造成肝郁證模型，造模成功將動(dòng)物處死，測(cè)T水平，光鏡結(jié)合圖像分析系統(tǒng)觀察Leydig細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)。結(jié)果模型組T水平為（71.41±43.97） ng/ml，空白組T水平為（155.03 ±93.14）ng/mL，兩組比較差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；睪丸病理形態(tài)示：Leydig 細(xì)胞數(shù)量模型組為（19.67± 8.70），空白組為（33.17±13.59），模型組數(shù)量減少，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且模型組細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核不規(guī)則。結(jié)論肝郁證可降低SD大鼠T水平和減少Leydig 細(xì)胞數(shù)量。

肝郁證; 睪酮; 萊迪希細(xì)胞; 大鼠, Sprague-Dawley

近年來，隨著社會(huì)的發(fā)展，男性的生殖能力存在下降的趨勢(shì)，不育患者逐年增多，約占育齡夫婦的10%～15%，導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因復(fù)雜，其中情志因素具有重要的作用，從中醫(yī)理論來講多與肝郁相關(guān)[1,2]。我們的前期研究表明[3]，肝郁證SD大鼠的生殖功能明顯降低，但其可能機(jī)制暫不清楚，故通過對(duì)肝郁證SD大鼠的血清睪酮（T）及間質(zhì)細(xì)胞的變化來了解其可能的機(jī)制。

材料和方法

一、材料

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD全雄性大鼠，18只，6月齡，體質(zhì)量180～220g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（川實(shí)動(dòng)管127號(hào)）。實(shí)驗(yàn)期間飼養(yǎng)于室溫（20±3.0）℃，自由攝食全價(jià)大顆粒飼料，飲水，馴養(yǎng)1周后使用。

（二）實(shí)驗(yàn)材料

自制枷鎖套；睪酮放射免疫分析試劑盒，購(gòu)于北京北方生物技術(shù)研究所，批號(hào)：070520；睪丸組織固定液Bouin's液。

（三）主要儀器設(shè)備

GC-1200r放射免疫計(jì)數(shù)器，科大創(chuàng)新股份有限公司；賽多利斯BP-61型電子天平，德國(guó)；OLIMPUS CHC型生物顯微鏡，日本；LDR-4.8C大容量低速冷凍離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

二、方法

（一）實(shí)驗(yàn)分組

適應(yīng)性馴養(yǎng)1周后，將18只SD雄性大鼠隨機(jī)分為兩組：造模組12只，空白組6只。

（二）造模方法

參照陳小野的造模方法[4]，模型組采用自制頸部枷鎖套在大鼠的脖子上，同時(shí)加用自制的腳鐐束縛其雙后足。

（三）飼養(yǎng)方法

模型組每籠1只常規(guī)喂養(yǎng)，分別標(biāo)號(hào)；空白組每3只一籠常規(guī)喂養(yǎng)，分別標(biāo)號(hào)。每日密切觀察動(dòng)物情況，隨時(shí)調(diào)整模具。

三、觀察項(xiàng)目及檢測(cè)指標(biāo)

（一）一般狀態(tài)的觀察

自造模日開始，每日定時(shí)觀察并記錄大鼠日間理毛、撓癢等活動(dòng)情況及毛發(fā)的光澤、大便、精神狀態(tài)等一般狀況。

（二）血清睪酮的檢測(cè)

取大鼠股動(dòng)脈血5ml，4℃冰箱靜置，制備血清2ml左右，保存于-20℃冰箱中待用。采用放射免疫法測(cè)定，由我院核醫(yī)學(xué)科檢測(cè)。

（三）睪丸Leydig細(xì)胞的觀察

1. 病理切片的制備 取右側(cè)睪丸剝離被膜后置于Bouin's液中固定24h。取出修整后，依次用50%→ 70%→80%→90%→95%→100%→100%乙醇梯度脫水，再用二甲苯透明，石蠟包埋，組織切片機(jī)上連續(xù)切片，厚度4μm，用于HE染色。

2. 病理切片的HE染色 具體步驟如下：（1）取石蠟切片置95%乙醇和乙醚混合液（1:1）中固定15min；（2）流水洗2min，蒸餾水洗1min；（3）蘇木素染液染色5min，水洗后1%鹽酸酒精分化；（4）流水浸洗15min后，伊紅染液染1min；（5）95%乙醇和無水乙醇各浸洗2次，每次1min；（6）苯酚二甲苯（1:3）浸洗5min，二甲苯浸洗2次，每次3min；中性樹脂封片保存。

3. 睪丸Leydig細(xì)胞的觀察 取已制備的HE染色片在光鏡下觀察（分別用100倍、200倍）每張片子隨機(jī)選取5個(gè)視野，用德國(guó)萊卡QWIN圖像采集系統(tǒng)采集圖像。分析Leydig細(xì)胞數(shù)量：隨機(jī)選取5個(gè)視野（×100倍），計(jì)算平均每個(gè)視野間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量。肉眼觀察Leydig細(xì)胞大小和Leydig細(xì)胞核形態(tài)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件包進(jìn)行處理，各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，組間比較用兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般狀態(tài)的觀察

模型組7d后，開始出現(xiàn)反應(yīng)和行為遲緩，皮毛枯黃，眼睛瞇小，有眼眵，糞便干、少、小，倦怠食少，爪甲紫暗，尾巴呈棕紅色，且有鱗片出現(xiàn)。此與陳小野頸部枷鎖造模法7～10d的效果符合，造模大鼠已出現(xiàn)肝郁表現(xiàn)。繼續(xù)到第3周，模型組大鼠除上述表現(xiàn)外還出現(xiàn)體質(zhì)量顯著下降，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，籠內(nèi)貼邊等。

二、大鼠T 水平的表達(dá)

空白組T為（155.03±93.14）ng/mL，模型組為（71.41±43.97）ng/mL。與空白組比較，模型組T水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

三、大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)

空白組間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目為33.17±13.59，模型組為19.67±8.70。與空白組比較，模型組間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

在光鏡下可觀察到空白組睪丸間質(zhì)細(xì)胞成群分布，體積較大，核圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央。模型組與空白組相比Leydig細(xì)胞數(shù)量減少，見圖1。

圖1 兩組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)比較

討 論

當(dāng)今社會(huì)，競(jìng)爭(zhēng)激烈，人們的生活壓力逐步增大，男性精液質(zhì)量呈不斷下降的趨勢(shì)，男性不育癥逐年增多，情志因素在男性不育的發(fā)病中越來越引起了大家的重視，隨著醫(yī)學(xué)模式的轉(zhuǎn)變，人們?cè)絹碓街匾曅睦砑吧鐣?huì)因素在疾病發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中的作用，同時(shí)也更加關(guān)注疾病對(duì)患者心理狀態(tài)及社會(huì)功能的影響[5]。

在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中情志因素多屬肝郁范疇，且對(duì)男性生殖功能的影響早有記載，如明代醫(yī)家陳士鐸《石室秘篆子嗣論》中指出“肝氣郁塞，不能生胞中之火，則懷抱憂愁，而陽(yáng)氣因之不振，或臨爐而興已闌，或?qū)径旰龅??！背浞终f明肝氣郁結(jié)，疏泄失常是造成男性不育的主要因素。臨床上，對(duì)不育證的肝郁患者，采用疏肝解郁為主，臨床療效滿意[6,7]，進(jìn)一步印證了肝郁證對(duì)男性生殖功能具有一定的影響，但其具體機(jī)制有待研究。

本實(shí)驗(yàn)研究表明：與空白組相比，模型組血清睪酮水平、睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)目都較其偏低，且兩組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。研究初步證實(shí)，肝郁證SD雄性大鼠血清睪酮水平降低和Leydig細(xì)胞數(shù)量的減少可能是導(dǎo)致其生殖能力下降的原因，為臨床上從肝論治男性不育證奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

本次實(shí)驗(yàn)由于受到眾多條件的限制，故存在不少問題和不足之處，例如：如能檢測(cè)血清游離睪酮水平則能更準(zhǔn)確的反映睪酮的變化；如能同時(shí)測(cè)定間質(zhì)細(xì)胞的凋亡，則能更清楚地了解肝郁證SD大鼠模型對(duì)生殖功能影響的機(jī)制等等。這些有待于今后改進(jìn)，從而更深入更全面地探討肝郁證對(duì)生殖功能的影響及其機(jī)制。

1 馬曉年主編. 現(xiàn)代性病學(xué). 第二版. 北京: 人民軍醫(yī)出版社, 2004: 348

2 Shchelochkov AM, Nefedova IF,Chernora SN,et al. The regional indicators of male fertility in the Samara oblast and cansative factors of their alterations.Klin Lab Diagn2012; (8): 25-29

3 張培海, 張科莊, 陳帝昂, 等. 肝郁證對(duì)雄性SD大鼠生殖功能影響的實(shí)驗(yàn)研究. 中國(guó)男科學(xué)雜志 2012; 26(3): 12-14

4 陳小野. 中醫(yī)證候動(dòng)物模型制備方法概論. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué) 1993; 19(3): 191-193

5 劉西茹, 李尚為, 李蕾. 不育癥患者心理因素及干預(yù)措施的研究進(jìn)展. 生殖醫(yī)學(xué)雜志 2005; 14(2): 125-128

6 趙麗華, 王衛(wèi)平. 辨證治療男性不育癥56例. 陜西中醫(yī)2004; 25(3): 231-232

7 李鈺琳. 男性不育癥的辨證論治. 河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2005; 20(4): 50

（2013-11-08收稿）

Study on level of serum testosterone and number of Leydig cell in SD rats suffer from liver depression

Zhang Peihai1,2, Li Guangsen2, Pan Junjie3, Zhang Kezhuang4, Yu XuJun5, You Yaodong2, Wu Tianlang2, Chang Degui5*1. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine 610072, China; 2. Urological and Andrology Department, Aff liated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Chengdu; 3. Urological Department, Sichuan Meishan Hospital of Traditional Chinese Medicine; 4. The Chinese People's Liberation Army 371th Center Hospital Urology Surgery; 5. The Second Aff liated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Chang Degui, E-mail: cdg998@sina.com

ObjectiveTo study the level of serum testosterone and the number of Leydig cells of SD rats with Liver depression.Methods18 six-month-old SD male rats were randomly divided into two groups such asthe model group(12 rats), the blank group(6 rats). Rats in the blank group were treated with conventional farming, and rats in the model group with homemade neck yoke and fetters, 21 days later, theywere induced into liver depression model . All rats were killed and their serum testosterone (T) levels were measured and the microstructure of the leydig cells were observed by light microscopy combined with image analysis system.ResultsSerum testosterone levels of the model group and the blank group were (71.41±43.97) ng/mL and (155.03±93.14) ng/mL, there was a signif cant differece between them (P<0.05); Testicular pathological patterns analysis showed that the number of Leydig cells of the model group (19.67±8.70) was obviously lower than that of the blank group (33.17±13.59,P<0.05) and the size of cells was smaller, the nuclei was irregular.ConclusionLiver depression might affect serum testosterone levels and the number Leydig cells thus injuryreproductive function.

Liver depression; testosterone; Leydig cells; rats, Sprague-Dawley

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.004

R 698.2

*通訊作者, E-mail: cdg998@sina.com