薛 珂 凡 永 劉 悅 丁之德

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系（上海 200025）

·論 著·

RNA酶T2在雄性小鼠生殖系統(tǒng)中的表達(dá)及對(duì)精子活動(dòng)力的影響

薛 珂 凡 永 劉 悅 丁之德*

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系（上海 200025）

目的檢測(cè)核糖核酸酶T2（ribonuclease T2, RNaseT2）在雄性小鼠生殖系統(tǒng)和精子中的表達(dá)、定位及其對(duì)精子活動(dòng)力及前向運(yùn)動(dòng)的影響。方法運(yùn)用免疫熒光染色鑒定RNaseT2蛋白在小鼠生殖系統(tǒng)中的表達(dá)、定位及其與肌動(dòng)蛋白（actin）在精子中的共定位關(guān)系，通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)RNaseT2 mRNA在小鼠生殖系統(tǒng)中的相對(duì)表達(dá)水平，借助計(jì)算機(jī)輔助精液分析（CASA）儀檢測(cè)RNaseT2對(duì)小鼠精子的活動(dòng)力、前向運(yùn)動(dòng)的影響。結(jié)果（1）RNaseT2蛋白及其mRNA在小鼠附睪頭、體、尾組織以及輸精管、前列腺及精囊腺分泌液中均有表達(dá)，而在睪丸組織中極低表達(dá)或未見表達(dá)。（2）在小鼠精子上，該蛋白定位于頂體、頸部、尾部鞭毛并與actin的表達(dá)定位具有一定的相似性。（3）體外純化的RNaseT2蛋白可明顯抑制小鼠精子的活動(dòng)力及前向運(yùn)動(dòng)，且抑制具有時(shí)間及劑量依賴性。結(jié)論 在雄性生殖系統(tǒng)中，RNaseT2蛋白作為精子運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)因子對(duì)精子的活動(dòng)力及前向運(yùn)動(dòng)具有明顯的抑制作用。

核糖核酸酶T2; 雄性生殖系統(tǒng); 精子活動(dòng)力; 小鼠

近年來(lái)，男性不育癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)男性身心健康造成了嚴(yán)重的影響。男性不育癥的病因主要包括性功能障礙和精液質(zhì)量異常兩個(gè)方面，其中后者根據(jù)精液分析結(jié)果可進(jìn)一步劃分為無(wú)精子癥、少精子癥、死精子癥、弱精子癥及少弱精癥等。有研究表明，81.84%男性不育癥患者存在精子運(yùn)動(dòng)不良，其中19%的患者精子僅在組織形態(tài)學(xué)上存在異常[1]，而在精子數(shù)量上無(wú)任何差異，表明精子運(yùn)動(dòng)功能下降是導(dǎo)致該病發(fā)生的重要因素。因此，尋找導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)功能下調(diào)的關(guān)鍵分子，成為目前研究的熱點(diǎn)，其研究結(jié)果對(duì)探索男性不育癥的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。

核糖核酸酶T2（ribonuclease T2，RNaseT2）是一類特殊的底物非特異性的核糖核酸內(nèi)切酶，其廣泛表達(dá)在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞中，往往作為分泌蛋白被分泌到細(xì)胞間質(zhì)中[2]。RNaseT2家族成員之一的ACTIBIND是一種由黑曲霉菌合成的蛋白。研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)ACTIBIND與靶細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白（actin）結(jié)合后，可阻斷細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移[3,4]。我們?cè)谇捌谘芯恐袌?bào)道人精子和精漿中均存在一定量的RNaseT2，其在人精子中的表達(dá)及定位與肌動(dòng)蛋白有部分相似，尤其是在精子動(dòng)力相關(guān)的尾部[5]，提示RNaseT2在精子成熟、獲能、頂體反應(yīng)等過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用[6-9]。本研究將運(yùn)用免疫熒光的方法分析RNaseT2蛋白在小鼠生殖系統(tǒng)中的表達(dá)、定位及其與肌動(dòng)蛋白在精子中的共定位關(guān)系，并進(jìn)一步從黑曲霉菌的培養(yǎng)液中分離純化出較高純度并且具有生物學(xué)活性的RNaseT2蛋白，體外將其與小鼠精子共孵育后，檢測(cè)RNaseT2蛋白對(duì)小鼠精子活動(dòng)力及前向運(yùn)動(dòng)的影響，為進(jìn)一步探索男性不育癥診斷與治療的新方法奠定必要的理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性ICR小鼠， 10～12周齡，購(gòu)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

二、主要試劑與儀器

（一）試劑

Trizol（Invitrogen），逆轉(zhuǎn)錄酶（Takara），SYBR GreenPCR Master Mix（applied biosystems），正常兔IgG（Upstate），實(shí)驗(yàn)室自制兔抗RNase T2抗體，兔抗actin抗體（CST），F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（Invitrogen），EMD-TMAE 層析填料（Merck），Mono Q層析填料（GE），Tyrode’s buffer（Sigma）。

（二）儀器

紫外/可見分光光度計(jì)（Nano Drop ND-1000 Spectrophotometer），PTC-200 PCR 儀（MJ Research），激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss LSM-510），計(jì)算機(jī)輔助精液分析儀（Hamhlton CX-41）。

三、方法

（一）小鼠精子的分離提取

采用頸椎脫臼法處死小鼠，分離取下附睪尾部后，置于含37℃預(yù)熱的Tyrode’s buffer培養(yǎng)液中，稍剪碎組織并靜置15min，待精子由附睪內(nèi)游出后，吸取含有精子的Tyrode’s buffer上清液。

（二）RNaseT2在雄性小鼠生殖器官及與actin在精子中免疫共定位

將雄性小鼠頸椎脫臼處死后，剝離剪下睪丸、附睪頭、附睪尾、輸精管、前列腺、精囊腺等組織。將各個(gè)組織用OCT液包埋，冰凍切片機(jī)切成7μm 大小的切片并黏附于載玻片上。與此同時(shí)，將另一側(cè)附睪內(nèi)分離出的精子均勻涂于載玻片上，各載玻片上的組織或精子風(fēng)干后，用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定15min。PBS漂洗后 5%的牛血清白蛋白溶液封閉1h，再與實(shí)驗(yàn)室自制兔抗RNaseT2蛋白抗體（1:100）及兔抗actin抗體（1:100）4℃孵育過(guò)夜，并以同樣濃度的正常兔IgG抗體作為陰性對(duì)照。次日，以FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1:500）37℃孵育1h，PBS漂洗3次后封片，隨后在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光定位觀察。

（三）實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Real-time PCR）

采用Trizol法分別提取睪丸、附睪頭、附睪體、附睪尾、輸精管、前列腺和精囊腺組織的總RNA，并通過(guò)RT Master Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RNase T2引物設(shè)計(jì)采用PRIMER 5.0軟件設(shè)計(jì)引物上游引物5' TCAAGCCATCCATCAACT 3'，下游引物5' TTCCGCAAATGTAAGTCC 3'，檢測(cè)系統(tǒng)為Applieed Biosystems Real-Time PCR，反應(yīng)條件如下：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 34s循環(huán)40次。通過(guò)測(cè)定Ct值表示目的基因mRNA表達(dá)量，基因表達(dá)的相對(duì)變化用2-△△Ct法分析表示。

（四）RNase T2蛋白的分離純化

將黑曲霉菌培養(yǎng)液經(jīng)針頭過(guò)濾器過(guò)濾后，在pH值為6，濃度為2 mmol/L的乙酸鈉溶液中透析72h，經(jīng)蛋白親和層析、陰離子交換層析及超濾濃縮后獲得RNaseT2蛋白，并經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western blot鑒定為純化RNaseT2蛋白[20]。

（五）檢測(cè)RNaseT2對(duì)精子活動(dòng)力的影響

篩選出精子活動(dòng)力較好且制備濃度在15～25×106個(gè)/mL的精子懸液，平均分為3份，分別加入RNaseT2溶液、RNaseA溶液及Tyrode’s培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，并定義為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及空白組。根據(jù)不同的RNaseT2濃度和時(shí)間點(diǎn)運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助精液分析儀檢測(cè)各組精子活動(dòng)力和前向運(yùn)動(dòng)。

（六）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件（Chicago，IL）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用單因素方差分析對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RNaseT2蛋白在雄性小鼠生殖系統(tǒng)中的表達(dá)及定位

間接免疫熒光染色結(jié)果顯示：在雄性小鼠生殖系統(tǒng)中，RNaseT2蛋白在睪丸組織中未見陽(yáng)性表達(dá)而在附睪頭部檢測(cè)出較高熒光強(qiáng)度，之后在附睪尾部、輸精管管腔內(nèi)、前列腺及精囊腺組織的腺腔中均檢測(cè)到熒光，提示RNaseT2在附睪頭部、附睪尾部、輸精管管腔液、前列腺及精囊腺組織及其分泌液中均有表達(dá)。

二、RNaseT2與actin在小鼠精子中的免疫熒光共定位

間接免疫熒光染色結(jié)果顯示：在小鼠精子中，RNaseT2蛋白主要分布在精子頂體區(qū)域、頸部及尾部，其定位與精子中actin蛋白的定位有部分相似，尤其是在精子動(dòng)力相關(guān)的尾部（圖1）。

三、RNaseT2 mRNA在小鼠生殖系統(tǒng)中的相對(duì)表達(dá)水平

Real-time PCR結(jié)果顯示：在小鼠生殖系統(tǒng)中，RNaseT2 mRNA在睪丸組織中表達(dá)水平極低，在附睪頭處呈現(xiàn)第一個(gè)表達(dá)高峰，到附睪體時(shí)開始下降，一直維持至精囊腺，隨后在前列腺處又出現(xiàn)第二個(gè)表達(dá)高峰。表明RNaseT2 mRNA水平在附睪頭部及前列腺組織中較高（圖2）。

圖1 RNaseT2與actin蛋白在小鼠精子中的免疫熒光定位

圖2 RNaseT2 mRNA在小鼠生殖系統(tǒng)中的相對(duì)表達(dá)水平

四、RNaseT2蛋白對(duì)小鼠精子活動(dòng)力及前向運(yùn)動(dòng)的影響

將不同濃度（5μg/mL、10μg/mL、25μg/ mL、50μg/mL、100μg/mL）的RNaseT2蛋白溶液，分別與小鼠精子懸液培養(yǎng)15min后，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助精液分析（CASA）儀檢測(cè)小鼠精子的活動(dòng)力及前向運(yùn)動(dòng)。結(jié)果顯示，與空白組及對(duì)照組（RNaseA組）相比，RNaseT2蛋白溶液可以明顯抑制小鼠精子活動(dòng)力及前向運(yùn)動(dòng)，且該作用具有明顯的劑量依賴性。當(dāng)RNaseT2蛋白溶液濃度為5μg/mL時(shí)即產(chǎn)生明顯抑制效應(yīng)，至100μg/mL時(shí)，效果最為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3 A，B）。

與此同時(shí)，為進(jìn)一步探討RNaseT2蛋白對(duì)小鼠精子活動(dòng)力及前向運(yùn)動(dòng)的抑制作用是否具有時(shí)間依賴性，我們將濃度為5μ/mL的RNaseT2蛋白溶液與小鼠精子懸液培養(yǎng)后，分別于不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)精子的活動(dòng)力和前向運(yùn)動(dòng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)30min時(shí)的小鼠精子活動(dòng)力和前向運(yùn)動(dòng)均要明顯低于15min時(shí)的小鼠精子活動(dòng)力（P＜0.05）及前向運(yùn)動(dòng)（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3 C，D），表明隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，RNaseT2對(duì)小鼠精子活動(dòng)力及前向運(yùn)動(dòng)力的抑制效果逐漸增大。

圖3 RNaseT2蛋白對(duì)小鼠精子活動(dòng)力及前向運(yùn)動(dòng)的影響

討 論

我們?cè)谇捌谘芯恐袌?bào)道了人精子和精漿中均存在一定量的RNaseT2[5]，為明確RNaseT2是否也存在于小鼠的精子中及其在小鼠生殖過(guò)程中的作用。我們首先檢測(cè)了RNaseT2蛋白在小鼠睪丸、附睪頭、附睪尾、輸精管、前列腺及精囊腺組織中表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小鼠生殖系統(tǒng)中，RNaseT2蛋白的表達(dá)起始于附睪頭部，并且大量集中在附睪頭上皮，并在附睪頭、附睪尾、輸精管、前列腺及精囊腺組織中均有陽(yáng)性表達(dá)，而在睪丸組織中未見陽(yáng)性信號(hào)。此外，Real-time PCR結(jié)果也顯示與附睪等器官相比，RNaseT2 mRNA在睪丸組織中的相對(duì)表達(dá)水平也處于極低的狀態(tài)，表明RNaseT2可能與睪丸中精子的發(fā)生無(wú)關(guān)，而附睪等器官中RNaseT2可能參與了精子成熟、頂體反應(yīng)等過(guò)程。

研究發(fā)現(xiàn)，actin蛋白可定位在兔、公牛等哺乳動(dòng)物精子的頭部、頸部以及尾部區(qū)域[10,11]，在精子的活動(dòng)力中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[6-9]，其解聚與重組可直接影響精子的形態(tài)學(xué)改變并通過(guò)精子尾部的超微結(jié)構(gòu)影響其活動(dòng)力[12-15]。因此，我們進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光的方法對(duì)RNaseT2蛋白與actin蛋白在小鼠精子中共定位進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠精子中兩者的定位具有部分的相似性。該結(jié)果與我們?cè)鴪?bào)道的人精子中RNaseT2蛋白與actin共定位表達(dá)的結(jié)論相一致[5]，表明RNaseT2蛋白與actin蛋白具有相互結(jié)合的空間基礎(chǔ)，進(jìn)一步支持RNaseT2可能參與了精子成熟、頂體反應(yīng)的推論。

另一方面，肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白在精漿及精子中的表達(dá)分別與精子質(zhì)量及精子成熟、頂體反應(yīng)密切相關(guān)[16,17]。而本身作為一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的RNaseT2也具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞增殖與遷移的能力[18]，其機(jī)制是RNaseT2家族成員ACTIBIND可以通過(guò)與血管生成素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白，從而引起腫瘤細(xì)胞（比如黑色素瘤）內(nèi)肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞、血管生成受到抑制，最后導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、活動(dòng)及遷徙的停滯[3,4]。這說(shuō)明RNaseT2并非通過(guò)其RNase酶的活性抑制細(xì)胞的活動(dòng)，而是通過(guò)與肌動(dòng)蛋白結(jié)合間接產(chǎn)生作用[19]。

為了進(jìn)一步明確RNaseT2對(duì)精子活動(dòng)力及遷移能力是否同樣具有抑制作用，我們從黑曲霉菌的培養(yǎng)液中分離純化出較高純度并且具有生物學(xué)活性的RNaseT2蛋白，將其與小鼠精子共孵育后，并以相同濃度的RNAseA作為對(duì)照組，經(jīng)檢測(cè)后統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)RNaseT2蛋白在體外能明顯抑制小鼠精子的活動(dòng)力及前向運(yùn)動(dòng)力，并且該抑制作用呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性，表明作為精子運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)因子之一，RNaseT2蛋白對(duì)小鼠精子活動(dòng)具有明顯的抑制作用。因此，通過(guò)本研究可為今后系統(tǒng)研究RNaseT2生物學(xué)功能及其對(duì)精子活動(dòng)力調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制奠定必要的理論基礎(chǔ)并提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（2014-04-18收稿）

The expression and localization of RNase T2 in male mouse reproductive system and its effects on sperm motility

Xue Ke, Fan Yong, Liu Yue, Ding Zhide*Department of Anatomy, Histology and Embryology School of Medicine,Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200025,China

Ding Zhide, E-mail: zding@shsmu.edu.cn

Objective To analyze the expression and distribution of RNase T2 in male mouse reproductive system and explore its effects on sperm motility.MethodsThe expression and localization of RNase T2 in the male mouse reproductive system and its co-localization with actin on mature spermatozoa were detected by indirect immunof uorescence analysis. The expression of RNase T2 in male mouse reproductive system was measured by real-time PCR. The effect of RNase T2 on mouse sperm motility and progressive motility were analyzed by a computer assisted semen analyzer (CASA).Results1. RNase T2 was expressed in mouse epididymal caput, corpus, and cauda, and secretions of vas deferens, prostate and seminal vesicle, however no Rnase T2 was found in mouse testis. 2. RNase T2 was co-localized with actin on the sperm head, neck and the tail regions. 3. RNase T2 had an inhibitory effect on the sperm motility and progressive motility in a dosedependent and time-dependent manners.ConclusionAs a regulator for sperm motility, RNase T2 in male reproductive system has a def nitely inhibitory effect on the motility and progressive motility of mouse spermatozoa.

ribonuclease T2 (RNase T2); male reproductive system; sperm motility; mouse

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.001

R 331.55; R 39

*通訊作者, E-mail: zding@shsmu.edu.cn