李 明，李 璽*，權(quán)乾坤，袁海峰，李 源，王 娟

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人參皂苷Rg1對(duì)阿爾茨海默病大鼠腦片模型tau蛋白磷酸化的影響

李 明1，李 璽1*，權(quán)乾坤1，袁海峰2，李 源3，王 娟4

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院：1老年病科，2腦病科，西安 710004；3西安市電力中心醫(yī)院腦病科，西安 710032；4第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)中心，西安 710032）

觀察人參皂苷Rg1對(duì)阿爾茨海默?。ˋD）大鼠腦片模型中磷酸化tau蛋白（P-tau）及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）表達(dá)的影響，探討人參皂苷Rg1是否通過(guò)上調(diào)CaN表達(dá)從而抑制AD模型大鼠腦片tau蛋白磷酸化。制備5周齡雄性SD大鼠腦片（含皮質(zhì)和海馬），隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、模型組和人參皂苷Rg1組，人參皂苷Rg1＋他克莫司（FK506）（一種CaN抑制劑）組，每組10張腦片。各組腦片首先置于人工腦脊液中孵育1h，之后人參皂苷Rg1組和人參皂苷Rg1＋FK506組分別加入人參皂苷Rg1作用2h，然后除對(duì)照組外的各組分別加入岡田酸作用3h。干預(yù)結(jié)束后腦片經(jīng)多聚甲醛固定后做冰凍切片，采用免疫組織化學(xué)染色、圖像分析技術(shù)等方法檢測(cè)各組大鼠腦片P-tau、CaN的表達(dá)水平。與對(duì)照組比較，模型組各腦區(qū)P-tau表達(dá)水平增加（＜0.05），CaN表達(dá)水平減少（＜0.05）；與模型組比較，人參皂苷Rg1組各腦區(qū)P-tau表達(dá)水平減少（＜0.05），CaN表達(dá)水平增加（＜0.05）；與人參皂苷Rg1組比較，人參皂苷Rg1＋FK506組P-tau表達(dá)水平增加（＜0.05），CaN表達(dá)水平減少（＜0.05）。人參皂苷Rg1可能通過(guò)上調(diào)CaN蛋白表達(dá)途徑抑制AD大鼠腦片模型tau蛋白磷酸化，從而發(fā)揮抗癡呆作用。

人參皂苷Rg1；阿爾茨海默病；磷酸化tau蛋白；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）的核心病理變化之一是神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangle，NFT）形成，其產(chǎn)生原因是tau蛋白過(guò)度磷酸化致使微管正常功能喪失所致[1]。并且NFT的數(shù)目與AD患者的癡呆程度密切相關(guān)[2]。研究表明，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）的活性下降在AD的tau蛋白異常磷酸化中發(fā)揮了重要的作用[3]。而且，CaN活性缺陷所致的tau蛋白異常磷酸化是一個(gè)可逆的生理過(guò)程，CaN激活劑有望在這一過(guò)程中扮演重要的角色。人參皂苷Rg1是人參的主要成分之一，有增強(qiáng)記憶和認(rèn)知功能的作用[4]。目前研究已證實(shí)人參皂苷Rg1可以通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5（CDK5）的表達(dá)[5]，下調(diào)蛋白激酶A（PKA）的表達(dá)[6]等途徑以抑制tau蛋白磷酸化，但其對(duì)CaN的研究未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用磷酸酯酶抑制劑岡田酸（okadaic acid，OA）孵育大鼠腦片制備tau蛋白過(guò)度磷酸化AD大鼠腦片模型，觀察人參皂苷Rg1對(duì)AD大鼠腦片模型中磷酸化tau蛋白（phosphorylated tau protein，P-tau）及CaN表達(dá)的影響，擬闡明人參皂苷Rg1是否通過(guò)上調(diào)CaN蛋白表達(dá)途徑以降低AD大鼠腦片模型中P-tau水平，從而發(fā)揮抗癡呆作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

5周齡健康雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量110～130g，清潔級(jí)，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為SCXK（陜）2007-001。

1.2 主要試劑

人參皂苷Rg1，純度98.99%，吉林宏久生物科技股份有限公司；OA，美國(guó)Alexis生物制劑公司；CaN多克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；他克莫司（tacrolimus，F(xiàn)K506），愛爾蘭Fujisawa公司；P-tau（Ser202）多克隆抗體及SABC試劑盒、抗體稀釋液，武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 主要儀器

振動(dòng)切片機(jī)（上海之信儀器有限公司，型號(hào)：ZQP-86）；冰凍切片機(jī)（德國(guó)Microm公司，型號(hào)：HM500）；圖像處理與分析系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司，型號(hào)：Qwin550CW）；6孔培養(yǎng)板（美國(guó)Millipore公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 AD大鼠腦片模型制備 SD大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，斷頭取腦，快速置于0～4℃的人工腦脊液冰水混合物中，振動(dòng)切片機(jī)以振幅8檔，速度3檔行冠狀切片所切腦片含皮質(zhì)和海馬，平均厚度400μm。挑選形態(tài)較好的腦片（含皮質(zhì)和海馬）置入盛有人工腦脊液的6孔板中孵育，溫度（32.0±0.5）℃，整個(gè)過(guò)程人工腦脊液中持續(xù)通入混合氧氣（95%O2＋5%CO2）。人工腦脊液成分（mmol/L）：NaCl 150，CaCl22，MgSO41.2，KH2PO40.5，K2HPO41.5，葡萄糖10，pH7.4。

1.4.2 分組及干預(yù) 腦片隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、模型組、人參皂苷Rg1組、人參皂苷Rg1＋FK506組，每組10張腦片。人工腦脊液孵育1h，人參皂苷Rg1組加入人參皂苷Rg1 240μmol/L，人參皂苷Rg1＋FK506組加入人參皂苷Rg1 240μmol/L、FK506 1.25μmol/L，培養(yǎng)2h，然后模型組、人參皂苷Rg1組和人參皂苷Rg1＋FK506組分別加入OA（1μmol/L）孵育3h。對(duì)照組不加任何處理因素。

1.4.3 P-tau、CaN蛋白表達(dá)檢測(cè) 干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠腦片經(jīng)4%多聚甲醛固定4h，然后轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液浸泡至沉底，做冰凍切片，切片10μm厚，每張切片含皮層、海馬、齒狀回。采用免疫組化染色（SABC法）分別檢測(cè)各組腦片皮質(zhì)和海馬P-tau、CaN的蛋白表達(dá)情況。P-tau（Ser202）、CaN一抗?jié)舛确謩e為1∶1000和1∶600，染色步驟按說(shuō)明書進(jìn)行，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。采用圖像處理與分析系統(tǒng)檢測(cè)腦片陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)的平均灰度值，每張切片同一區(qū)域中，隨機(jī)選取6個(gè)視野，檢測(cè)面積相同，取其平均灰度值代表該切片目標(biāo)區(qū)域的蛋白表達(dá)水平?；叶戎翟降停?yáng)性表達(dá)量越高，反之灰度值越高，陽(yáng)性表達(dá)量越低。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 OA處理后腦片P-tau、CaN表達(dá)情況

與對(duì)照組比較，模型組各腦區(qū)P-tau陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)表達(dá)增加（＜0.05），CaN陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)表達(dá)減少（＜0.05；表1）。

表1 OA對(duì)AD大鼠培養(yǎng)腦片P-tau和CaN表達(dá)量的影響

OA: okadaic acid; AD: Alzheimer’s disease; CA1: CA1 area of hippocampus;CA3: CA3 area of hippocampus; DG: dentate gyrus. Compared with control group,*＜0.05

2.2 人參皂苷Rg1干預(yù)后各組大鼠腦片P-tau表達(dá)情況

與模型組比較，人參皂苷Rg1組P-tau陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)均有不同程度減少（＜0.05），與人參皂苷Rg1組比較，人參皂苷Rg1＋FK506組P-tau陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)均有不同程度增加（＜0.05；表2，圖1）。

2.3 人參皂苷Rg1干預(yù)后各組腦片CaN表達(dá)情況

與對(duì)照組比較，模型組CaN陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)表達(dá)明顯減少（＜0.05）。與模型組比較，人參皂苷Rg1組CaN陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)表達(dá)明顯增加（＜0.05）；與人參皂苷Rg1組比較，人參皂苷Rg1＋FK506組CaN陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)表達(dá)明顯減少（＜0.05；表3，圖2）。

圖1 各組大鼠腦片CA3區(qū)P-tau蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)

Figure 1 Expression of P-tau in CA3 of hippocampus in different groups (SABC ×400)

A: control group; B: model group; C: ginsenoside Rg1 group; D:ginsenoside Rg1+FK506 group. P-tau ( tan color ) is expressed in thecytoplasm of neurons in the brain slices, and P-tau expression is stronegest in model group, followed by ginsenoside Rg1+FK506 group, and the lowest in ginsenoside Rg1 and control groups

圖2 各組大鼠腦片海馬齒狀回CaN蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)

Figure 2 Expression of CaN protein in dentate gyrus of hippocampus in different groups (SABC ×400)

A: control group; B: model group; C: ginsenoside Rg1 group; D:ginsenoside Rg1+FK506 group. CaN (tan color) is expressed in thecytoplasm of neurons in the brain slices, and CaN expression is strongest in the control group, followed by ginsenoside Rg1 group, and the lowest in ginsenoside Rg1+FK506 and model groups

3 討 論

NFT是AD患者腦內(nèi)主要病理改變之一，其產(chǎn)生的原因是tau蛋白的過(guò)度磷酸化。tau蛋白是神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白，過(guò)度磷酸化后，會(huì)促進(jìn)微管組裝的生物活性喪失，導(dǎo)致細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)異常而形成NFT[7]。目前已發(fā)現(xiàn)tau蛋白有45個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中包括Ser202位點(diǎn)。OA是蛋白磷酸酶的高效選擇性抑制劑，目前被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)tau蛋白的過(guò)度磷酸化[8,9]，研究者在大鼠腦內(nèi)注射OA可誘導(dǎo)tau蛋白在Ser-198/Ser-199/Ser-202，Ser-396/Ser-404位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致大鼠空間記憶障礙[10]。本實(shí)驗(yàn)選用Ser202位點(diǎn)磷酸化進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腦片可見少量細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，膠質(zhì)細(xì)胞增生，未見細(xì)胞層厚度變化；免疫組化染色結(jié)果表明模型組大鼠腦片P-tau蛋白表達(dá)較對(duì)照組增加，推測(cè)OA可能誘導(dǎo)了大鼠腦片tau蛋白在Ser202位點(diǎn)發(fā)生磷酸化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，人參皂苷Rg1組P-tau蛋白表達(dá)較模型組明顯降低，而且人參皂苷Rg1這種作用可以被CaN抑制劑FK506有效抑制（人參皂苷Rg1＋FK506組與人參皂苷Rg1組之間比較，＜0.05）。這表明人參皂苷Rg1能有效減輕OA引起的Tau蛋白過(guò)度磷酸化，且這種作用可能與CaN相關(guān)。

表2 人參皂苷Rg1對(duì)AD模型大鼠腦片P-tau表達(dá)的影響

AD: Alzheimer’s disease; CA1: CA1 area of hippocampus; CA3: CA3 area of hippocampus; DG: dentate gyrus. Compared with control group,*＜0.05; compared with model group,#＜0.05; compared with ginsenoside Rg1 group,△＜0.05

表3 人參皂苷Rg1對(duì)AD模型大鼠腦片CaN表達(dá)的影響

CA1: CA1 area of hippocampus; CA3: CA3 area of hippocampus; DG: dentate gyrus. Compared with control group,*＜0.05; compared with model group,#＜0.05; compared with ginsenoside Rg1 group,△＜0.05

tau蛋白的磷酸化主要受蛋白激酶和蛋白磷酸酶的調(diào)節(jié)，蛋白磷酸酶活性的降低可能比蛋白激酶活性的升高在tau蛋白的磷酸化過(guò)程中起更大的作用[11]。體外磷酸化的tau蛋白去磷酸化可以使NFT松解，恢復(fù)tau蛋白的連接微管及發(fā)揮促微管組裝的功能[12]。研究發(fā)現(xiàn)，將CaN的抑制劑注入小鼠腦室腔里，可導(dǎo)致tau蛋白幾個(gè)特殊位點(diǎn)過(guò)度磷酸化[13]。體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)蛋白磷酸酶均可使P-tau蛋白發(fā)生去磷酸化，其中CaN導(dǎo)致P-tau去磷酸化的位點(diǎn)最多，另外CaN也是海馬區(qū)最主要的P-tau去磷酸化磷酸酶[14]。本實(shí)驗(yàn)采用人參皂苷Rg1對(duì)AD樣tau蛋白磷酸化大鼠腦片模型干預(yù)后，結(jié)果表明大鼠腦片CaN表達(dá)明顯增多，這種作用同樣可以被CaN抑制劑FK506有效抑制。這表明人參皂苷Rg1可能通過(guò)上調(diào)CaN表達(dá)途徑從而促進(jìn)P-tau去磷酸化。另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)CaN抑制劑FK506對(duì)人參皂苷Rg1下調(diào)P-tau作用的抑制是不完全的，推測(cè)除上調(diào)CaN途徑外，人參皂苷Rg1還可通過(guò)其他途徑促進(jìn)P-tau去磷酸化，這在未來(lái)實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)一步的證實(shí)。

總之，本研究證實(shí)了人參皂苷Rg1可能通過(guò)上調(diào)CaN蛋白表達(dá)途徑以降低AD大鼠腦片模型中磷酸化tau蛋白水平，從而發(fā)揮抗癡呆作用，為人參皂苷Rg1治療AD的研究提供了新靶點(diǎn)、新思路。

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（編輯: 周宇紅）

Effect of gensenoside Rg1 on tau phosphorylation in rat brain slice model of Alzheimer’s disease

LI Ming1, LI Xi1*, QUAN Qian-Kun1, YUAN Hai-Feng2, LI Yuan3, WANG Juan4

(1Department of Geriatrics,2Department of Encephalopathy, the Second Affiliated Hospital, College of Medicine, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China;3Department of Encephalopathy, Xi’an Central Hospital of Electrical Power Inc, Xi’an 710032, China;4Center for Laboratory Medicine, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

To determine the effect of ginsenoside Rg1 on the expression of phosphorylated tau protein(P-tau) and calcineurin (CaN) in a rat brain slice model of Alzheimer’s disease (AD) induced by okadaic acid (OA), and to investigate whether gensenoside Rg1 inhibits tau phosphorylation through up-regulating CaN in the process.Brain slices (containing cerebral cortex and hippocampus) in 400 μm thickness were obtained from 5-week-old SD rats, and then randomly divided into control, model, ginsenoside Rg1 and ginsenoside Rg1＋tacrolimus (FK506, CaN inhibitor) groups, with 10 slices in each group. All these brain slices were cultured with artificial cerebrospinal fluid (ACSF) firstly, and then ginsenoside Rg1 with or without FK506 was added into the ACSF of the corresponding groups for 2 h. Then, OA was administrated into ACSF of model, ginsenoside Rg1 and ginsenoside Rg1+FK506 groups separately for 3 h to induce tau phosphorylation to prepare AD model. There was no any intervention for the control group. Expression of P-tau and CaN proteins in brain slices as determined by immunohistochemical staining, and the results were analyzed by image acquisition and analysis system.Compared with the control group, the level of P-tau protein was significantly higher (＜0.05) and that of CaN protein was obviously lower (＜0.05) in the model group. Compared with the model group, the expression of P-tau was markedly lower (＜0.01) and that of CaN protein was remarkably higher (＜0.05) in the ginsenoside Rg1 group. Compared with the ginsenoside Rg1 group, the expression of P-tau was higher (＜0.01) and the expression of CaN protein was lower (＜0.05) in the ginsenoside Rg1+FK506 group.Ginsenoside Rg1 inhibits tau phosphorylation probably by enhancing CaN expression in rat brain slice model of AD, and thus exerts anti-dementia effect.

gensenoside Rg1; Alzheimer’s disease; phosphorylated tau protein; calcineurin

[2007K16-07(5)](2005030).

R745.7

A

10.3724/SP.J.1264.2014.000162

2014?06?03;

2014?07?11

陜西省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目[2007K16-07（5）]; 陜西省中醫(yī)藥管理局基金項(xiàng)目（2005030）

李 璽, E-mail: lixi2100@sohu.com