李 偉

（1.湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院 湖北省生物資源保護(hù)與利用重點實驗室，湖北 恩施 445000）

扛板歸（Polygonum perfoliatum L.）又名河白草、地葡萄，分布于全國各地，生長在山野、路旁、荒地或河岸的草叢、灌叢中，資源豐富[1]?？赴鍤w的化學(xué)成分主要有黃酮苷、蒽苷、強心苷、酚類、鞣質(zhì)等，據(jù)《中藥大辭典》記載，扛板歸以其根和地上部全草入藥，具有利水消腫、清熱活血、解毒等功效[2-4]。目前多以全草藥效進(jìn)行研究，對其所含黃酮成分的藥用和食用價值的開發(fā)利用尚未見報道?？嗖耍⊿onchus oleraceus L.）在我國很早就被當(dāng)作一種野菜食用，屬無毒害純天然綠色食品，具有很高的營養(yǎng)價值和明顯的抗氧化作用[5-6]。由于利用超聲波產(chǎn)生的強烈振動、高的加速度、強烈的空化效應(yīng)、攪拌作用等，可加速植物材料中的有效成分進(jìn)入溶劑從而增加有效成分的提取率，縮短提取時間，并且可避免高溫對提取成分的影響[7-9]。本研究主要以扛板歸為原料，采用超聲波對其黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并用優(yōu)化的工藝浸提苦菜黃酮，而后對比2種原料黃酮的體外抗氧化作用，以期為扛板歸和苦菜資源的開發(fā)利用提供新的信息資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

扛板歸全草、苦菜全草：采于湖北民族學(xué)院，洗凈、烘干、粉碎過80目篩備用。

蘆丁（純度≥95%）：西安艾沃生物科技有限公司；1，10鄰菲羅啉（鄰二氮菲）（分析純）：沈陽市新光化工廠；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、石油醚、過氧化氫、水楊酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722S可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-5220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；HH-8電子恒溫水浴鍋：深圳國華儀器廠；FA2104電子天平：上海天平儀器廠；800B離心機：上海安亭儀學(xué)儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃酮含量測定方法

NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法[10-11]。

以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品；以蘆丁的質(zhì)量C（mg）為橫坐標(biāo)，以吸光度值A(chǔ)510nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A510nm=0.007 5+1.235 2C，r=0.999 6。樣品中黃酮含量計算式：

式中：T 為供試液總體積，mL；V 為測定時吸取的樣品體積，mL；W 為樣品質(zhì)量，g；A 為510nm 波長下測定吸光度值。

1.3.2 扛板歸黃酮的提取工藝優(yōu)化

首先對乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波時間、料液比進(jìn)行單因素試驗，而后采用L9（33）正交設(shè)計，對其提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3 黃酮對羥自由基的清除作用

黃酮在水楊酸體系中對羥自由基的清除作用：參照莫開菊等[12-13]的試驗方法進(jìn)行測定，利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在波長510nm處有最大吸收。反應(yīng)體系中含6mmol/L H2O2溶液、1.5mmol/L FeSO4溶液、10mmol/L水楊酸-乙醇1mL、不同質(zhì)量濃度的樣品溶液1mL。最后加H2O2啟動反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5h。試劑的加入情況見表1。

表1 水楊酸體系中加入試劑的方法Table 1 Method of adding reagents in the salicylic acid system

式中：A0為空白溶液吸光度值；AX為加入樣品后的體系吸光度值；AX0為樣品本底吸光度值。

黃酮在鄰二氮菲體系中對羥自由基的清除作用：參照金鳴等[14]的方法進(jìn)行測定。Fe2+/H2O2體系產(chǎn)生·OH自由基，由于·OH可特異地使鄰二氮菲-Fe2+轉(zhuǎn)化為鄰二氮菲-Fe3+，從而使紅色褪色，根據(jù)反應(yīng)后體系的褪色程度，可衡量·OH的量。

體系含有0.75mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液1mL，2mL 0.2mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）2mL，0.75mmol/L硫酸亞鐵1mL，樣品溶液0.2mL，混勻后加1mL 0.01%的雙氧水，37℃水浴加熱60min后，在波長536nm處測定吸光度值。分組及各試劑加入方法見表2。

表2 在鄰二氮菲體系內(nèi)各試劑加入方法Table 2 Method of adding reagent in the phenanthroline system

2 結(jié)果分析

2.1 扛板歸黃酮化合物的提取工藝優(yōu)化

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對扛板歸黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取0.5g脫脂扛板歸干粉，以1∶30料液比，分別加入體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%的乙醇，超聲波提取30min，浸提結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on flavonoids yield

由圖1可以看出，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加黃酮得率增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過70%時黃酮得率反而下降，采用極差法分析[15]乙醇體積分?jǐn)?shù)對扛板歸黃酮得率的影響，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時的黃酮得率與其他水平的得率相比，差異都極顯著。因此選擇最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.1.2 超聲時間對扛板歸黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取0.5g脫脂扛板歸粉末，采用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，料液比1∶50超聲波處理10min、20min、30min、40min、50min、60min，黃酮浸提結(jié)果見圖2。在10～40min內(nèi)隨超聲處理時間增加，黃酮得率增加，超過40min后，黃酮得率反而逐漸減少，可能是因此超聲波在處理過程中具有一定的熱效應(yīng)，長時間的超聲波處理使已經(jīng)浸提出來的黃酮被氧化從而導(dǎo)致含量下降，因比選擇40min為最佳超聲時間。

2.1.3 料液比對扛板歸黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取0.5g脫脂扛板歸粉末，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，分別以1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70料液比超聲波處理40min，黃酮浸提結(jié)果見圖3。圖3結(jié)果表明，料液比越大，黃酮得率越高，但從1∶50開始，增加幅度趨于緩和，采用極差法分析在0.01水平1∶50、1∶60、1∶70料液比對扛板歸黃酮得率的影響差異不顯著，考慮到產(chǎn)業(yè)化和環(huán)境問題，選擇1∶50為最佳料液比。

圖2 超聲波處理時間對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on flavonoids yield

圖3 料液比對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of liquid to solid ratio on flavonoids yield

2.1.4 扛板歸黃酮提取工藝優(yōu)化的正交試驗

扛板歸黃酮提取工藝優(yōu)化的正交試驗結(jié)果如表3。

表3 黃酮提取的正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment for optimization of flavonoids extraction

采用SPSS17.0軟件對表3試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析[20]，結(jié)果見表4。

表4 正交試驗方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment for optimization of flavonoids extraction

由表3、表4可得出超聲波提取黃酮化合物的最佳工藝是A3B1C3，影響其得率的主次因素是B＞C＞A，即乙醇體積分?jǐn)?shù)最為顯著，其次是超聲時間和料液比。各因素水平的分析（見表3、表4）說明A因素的各個水平間差異并不顯著，B因素的3水平間差異非常顯著，C因素的1、2水平差異不明顯，2、3水平差異較大。按照試驗得出的最佳提取條件組合是A3B1C3，同時由于A因素對得率影響很小，選擇A1水平比A3水平節(jié)約成本，可獲得更好的效益。分別以A1B1C3和A3B1C3做驗證試驗，得出苦菜黃酮的得率分別為70.77mg/g和71.18mg/g，二者差異不顯著。在此條件下可得到苦菜黃酮得率為18.54mg/g。

2.2 扛板歸黃酮對自由基的清除作用

2.2.1 扛板歸黃酮在水楊酸體系中對羥自由基的清除作用

表5 黃酮類物質(zhì)在水楊酸體系對羥基自由基清除作用Table 5 The scavenging activity of flavonoids on·OH in salicylic acid system

由表5可在，在水楊酸體系，扛板歸黃酮對·OH的清除作用弱于苦菜黃酮，同時扛板歸黃酮對·OH的清除作用強于蘆丁弱于VC；苦菜黃酮對·OH清除作用約是蘆丁的8倍，與VC效果相比，略高于VC。

2.2.2 扛板歸黃酮在鄰二氮菲體系中對羥自由基的清除作用

表6 黃酮類物質(zhì)在鄰二氮菲體系對羥基自由基清除用Table 6 The scavenging activity of flavonoids on·OH in phenanthroline system

由表6可知，在鄰二氮菲體系，苦菜黃酮對·OH的清除作用略弱于蘆丁和VC，大約是VC和蘆丁活性的0.95～0.98倍左右?？赴鍤w黃酮對·OH的清除作用強于苦菜黃酮的，約是蘆丁和VC活性的2.5倍左右。

3 結(jié)論

利用超聲波浸提扛板歸和苦菜黃酮，通過單因素和正交試驗分析，優(yōu)化出扛板歸黃酮超聲波浸提的最佳條件為1∶50料液比，體積分?jǐn)?shù)65%的乙醇，進(jìn)行超聲波提取50min，在此條件下，扛板歸黃酮得率為70.77mg/g，苦菜黃酮得率為18.54mg/g。2種原料黃酮對在不同體系中對·OH的清除效果不同，總的來說在水楊酸體系中苦菜黃酮對·OH的清除效果強于扛板歸黃酮，在鄰二氮菲體系正好相反，具體原因還有待于進(jìn)一步探索。

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