鄭百芹，羅曉琴 *，馮才偉，董李學(xué)，賈芳芳，蒙君麗，郝立武，張書宏

（1.唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心，河北 唐山 063000；2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206）

喹諾酮類藥物是一類全合成的抗菌藥物[1-2]，具有抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中最重要的抗感染藥物之一[3-4]。隨著我國水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，近年來水污染影響嚴(yán)重，水產(chǎn)病害時(shí)有發(fā)生，因此，漁用獸藥用量越來越頻繁，導(dǎo)致了藥物殘留超標(biāo)問題。中國、日本、歐盟均對(duì)喹諾酮類藥物制定了最大允許限量，美國等一些國家未允許用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[5]。因此，研究對(duì)喹諾酮類藥物的檢測方法有著重要意義。

喹諾酮類藥物殘留的檢測手段有常規(guī)儀器法和快速檢測法。常規(guī)儀器法有高效液相色譜法、氣相色譜法、色質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)，快速檢測法有酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析法等[6-13]。本實(shí)驗(yàn)研究了水產(chǎn)品中氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨氟沙星等3種喹諾酮類藥物殘留的酶聯(lián)免疫吸附法。該方法的準(zhǔn)確性高于一般的快速檢測方法，檢測程序及所需條件較儀器法更方便，尤其便于現(xiàn)場大量樣本的檢測，更適于中小企業(yè)對(duì)成本控制的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品：北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；乙腈：北京百欣試劑公司；魚肉：市售；包被原、氧氟沙星單克隆抗體、酶標(biāo)二抗：北京勤邦生物技術(shù)有限公司。

0.1mol/L氫氧化鈉溶液：實(shí)驗(yàn)室自制；抗原稀釋液（0.05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）；復(fù)溶液（0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）；洗滌液（向0.02mol/L PBS中加入1%吐溫）；封閉液（在0.02mol/L PBS中加入0.05%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）；底物顯色液由A液和B液組成，A液為過氧化氫，B液為四甲基聯(lián)苯胺；終止液（2mol/L H2SO4）。以上實(shí)驗(yàn)用化學(xué)試劑：北京百欣試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MK3酶標(biāo)儀（最大量程為4.0）：上海雷勃分析儀器有限公司；MX-F渦旋儀：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；HFJ-10均質(zhì)器：湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 最佳抗原包被濃度、單克隆抗體濃度的確定

以棋盤法確定最佳抗原包被濃度，氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為0，0.2μg/L，抗原液稀釋倍數(shù)：2 000、6 000、18 000；單克隆抗體液稀釋倍數(shù)：10 000、30 000、90 000、270 000；根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期已有基礎(chǔ)，選擇的酶標(biāo)二抗液稀釋倍數(shù)為1 000。

1.3.2 喹諾酮類藥物試劑盒的制備

以100μL適宜稀釋倍數(shù)的抗原稀釋液包被96孔酶標(biāo)板，37℃孵育2h，然后用洗滌液洗板3次，拍干，用150μL封閉液封閉，37℃孵育2h，取板后拍干即可。

1.3.3 喹諾酮類藥物試劑盒配套試劑

96孔酶標(biāo)板，標(biāo)準(zhǔn)品1～6（質(zhì)量濃度分別為0、0.2μg/L、0.6μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、16.2μg/L），高質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量濃度為1mg/L），酶標(biāo)二抗，抗體工作液（即以最佳稀釋濃度稀釋的單克隆抗體），底物液A液，底物液B液，終止液，20×濃縮洗滌液，5×濃縮復(fù)溶液。

1.3.4 樣本前處理方法

研究以魚肉為樣本，稱取2.0g均質(zhì)后的魚肉樣本至50mL聚苯乙烯離心管中，分別加入1mL 0.1mol/L氫氧化鈉溶液和7mL乙腈，用振蕩器振蕩5min，3 000r/min 以上，室溫（20～25℃）離心10min；移取2mL上清液至10mL潔凈干燥玻璃試管中于50～60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑患尤?mL 正已烷用渦旋儀渦動(dòng)30s，再加入1mL復(fù)溶工作液，渦動(dòng)30s，3 000r/min以上，室溫（20～25℃）離心5min；除去上層有機(jī)相，取下層水相50μL用于分析。

1.3.5 操作步驟

加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μL 到對(duì)應(yīng)的微孔中，然后加入酶標(biāo)二抗50μL/孔，再加入抗體工作液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250μL/孔，充分洗滌4～5次，每次間隔10s，潑掉板孔內(nèi)洗滌液，用吸水紙拍干。加入底物液A液50μL/孔，再加入底物液B液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min。加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處，測定每孔OD450nm值。

1.3.6 結(jié)果判定方法

標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的平均吸光度值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品（0標(biāo)準(zhǔn)）的平均吸光度值，再乘以100%，即：

式中：B 為一定質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液的平均吸光度值；B0為0μg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

1.3.7 ELISA方法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（μg/L）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物的實(shí)際質(zhì)量濃度。

1.3.8 喹諾酮類藥物試劑盒的鑒定

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，參照其操作步驟，分別加入最適量抗原、單抗和酶標(biāo)二抗，氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別以0、0.2μg/L、0.6μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、16.2μg/L加入，測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.9 試劑盒靈敏度和檢測限試驗(yàn)

對(duì)20份魚肉空白樣品進(jìn)行檢測，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)于各吸光度值的質(zhì)量濃度，以20份樣本質(zhì)量濃度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差表示方法檢測限（method detection limit，MDL）。

1.3.10 樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

以回收率作為方法準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)指標(biāo)，重復(fù)測定某一質(zhì)量濃度樣品的檢測結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）作為方法精密度評(píng)價(jià)指標(biāo)。

分別按0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L 3個(gè)質(zhì)量濃度的喹諾酮類藥物對(duì)魚肉樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，用3批不同試劑進(jìn)行測定。

1.3.11 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將試劑盒存放在4℃條件下，連續(xù)12個(gè)月，每個(gè)月測定一次；將試劑盒存放在37℃條件下，放置7d進(jìn)行測定。以上測定指標(biāo)均為試劑盒的最大吸光度值（零標(biāo)準(zhǔn)）、50%抑制濃度（half-inhibitory concentration，IC50）以及按0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L 3個(gè)質(zhì)量濃度的喹諾酮類藥物對(duì)魚肉樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)所測得的回收率，直到試劑盒的靈敏度和回收率開始下降為止，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果判斷試劑盒的穩(wěn)定性。

由于考慮到在運(yùn)輸和使用過程中，會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，因此將試劑盒在37℃保存條件下放置7d，測定試劑盒的各項(xiàng)指標(biāo)是否符合要求。

1.3.12 交叉反應(yīng)率試驗(yàn)

選擇與氧氟沙星具有類似結(jié)構(gòu)的藥物環(huán)丙沙星、氨氟沙星進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定，通過ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50%抑制濃度，用下式計(jì)算試劑盒對(duì)其他藥物的交叉反應(yīng)率：

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳抗原包被質(zhì)量濃度、單克隆抗體質(zhì)量濃度的確定

測定質(zhì)量濃度為0和0.2μg/L的氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值OD450nm，結(jié)果見表1。

試劑盒的最大光密度值（零標(biāo)準(zhǔn)）范圍應(yīng)在1.5～2.2，當(dāng)OD450nm（0.2μg/L）/OD450nm（0）的抑制率在70%～85%時(shí)，選擇抗原的最大稀釋倍數(shù)作為抗原效價(jià)，即抗原稀釋倍數(shù)為18 000，單克隆抗體液稀釋倍數(shù)為9 000。

表1 抗原效價(jià)篩選Table 1 Detection of the suitable dilution time of antigen

2.2 喹諾酮類藥物試劑盒的鑒定

ELISA方法測定氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，喹諾酮類藥物ELISA相關(guān)參數(shù)見表2。

圖1 氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ofloxacin

表2 喹諾酮類藥物ELISA相關(guān)參數(shù)Table 2 ELISA related parameters of quinolones

由表2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，說明方程線性良好。IC50值較小，說明試劑盒的靈敏度較好。氧氟沙星、環(huán)丙沙星和氨氟沙星的檢測限均為1μg/kg。

2.3 樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

以0.5μg/kg、1.0μg/kg、2.0μg/kg 3個(gè)質(zhì)量濃度的氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨氟沙星分別對(duì)魚肉樣品進(jìn)行添加，檢測結(jié)果見表3。

由表3可知，平均回收率在62.8%～97.7%之間，說明方法準(zhǔn)確性較高；批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，說明方法精密度較好。由于經(jīng)高效液相色譜法測定添加回收實(shí)驗(yàn)的魚肉樣品的喹諾酮類藥物含量均在0.19μg/L以下，因此視為魚肉中喹諾酮類藥物含量為0。

表3 魚肉精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)Table 3 Precision and accuracy tests of fish sample

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將試劑盒分別在4℃條件下放置12個(gè)月、37℃條件下放置7d，經(jīng)過測定，試劑盒的最大光密度值（零標(biāo)準(zhǔn)）（1.5～2.2）、50%抑制濃度（0.6～1.8μg/L）、喹諾酮類藥物添加回收率（60%～100%）均在正常范圍之內(nèi)。

2.5 交叉反應(yīng)率試驗(yàn)

氧氟沙星抗體與其他喹諾酮類藥物的交叉反應(yīng)率見表4。

表4 氧氟沙星抗體與其他喹諾酮類藥物交叉反應(yīng)率試驗(yàn)Table 4 Cross reaction rate test of ofloxacin antibodies and other quinolones

由表4可知，氧氟沙星抗體與環(huán)丙沙星、氨氟沙星的交叉反應(yīng)率為100%，說明該抗體能夠用于檢測氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨氟沙星3種喹諾酮藥物，為研制可以同時(shí)檢測多種喹諾酮類藥物的ELISA試劑盒提供了可能。

3 結(jié)論與討論

我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T20366—2006《動(dòng)物源產(chǎn)品中喹諾酮類殘留量的測定》利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測喹諾酮類藥物殘留量，該種方法的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是所需儀器昂貴，需要專業(yè)的操作人員和較長的時(shí)間。因此，利用酶聯(lián)免疫試劑盒能夠比國標(biāo)方法更加快速、簡便地檢測出魚肉樣本中的喹諾酮類藥物含量，而該試劑盒的操作時(shí)間僅需45min，適合現(xiàn)場大量檢測樣本的檢測。

本實(shí)驗(yàn)在已有的技術(shù)平臺(tái)上，對(duì)影響喹諾酮類藥物ELISA試劑盒的各個(gè)條件進(jìn)行了研究，并確定了最佳的抗原液濃度和單克隆抗體濃度。通過一系列實(shí)驗(yàn)，確定了該試劑盒對(duì)氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氨氟沙星的檢測限均為1μg/kg，平均回收率為62.8%～97.7%，說明方法準(zhǔn)確性較高；批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，說明方法精密度較好。

SN/T 1751.1—2006《動(dòng)物源性食品中喹諾酮類藥物殘留檢測方法》的第一部分使用的方法是微生物抑制法。微生物法靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，但也有許多局限性，如整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期長，批次間檢測結(jié)果重復(fù)性差，檢測結(jié)果受樣品中所含抗喹諾酮類藥物或抗生素成分的影響等。由于某些不可避免的人為誤差，不同批次的ELISA試劑盒在制作過程中很難保證質(zhì)量完全一致，而本實(shí)驗(yàn)研制的喹諾酮類藥物檢測試劑盒的批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，重現(xiàn)性較好。

由于酶聯(lián)免疫試劑盒的試劑（尤其是酶）會(huì)受到溫度的影響，保存溫度的過高或過低都會(huì)對(duì)其質(zhì)量產(chǎn)生影響，因此穩(wěn)定性測試是評(píng)價(jià)試劑盒質(zhì)量的一個(gè)重要方面[14-15]。本實(shí)驗(yàn)通過分析該試劑盒在不同溫度下的保存時(shí)間，結(jié)果表明，當(dāng)試劑盒在4℃條件下保存12個(gè)月，在37℃條件下保存7d，測定的最大光密度值（零標(biāo)準(zhǔn)）、50%抑制濃度、喹諾酮類藥物添加回收率均在正常范圍之內(nèi)，驗(yàn)證了該試劑盒具有良好的穩(wěn)定性。

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