肖永剛，陳祥盛

(1.貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴州 貴陽 550025;2.貴州昆蟲資源開發(fā)利用省級特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025;3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025;4.宜賓學(xué)院實(shí)驗(yàn)與教學(xué)資源管理中心，四川 宜賓 645300)

線粒體細(xì)胞色素氧化酶第一亞基DNA(mt DNA)被認(rèn)為是動(dòng)物界中最適合的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因［1-2］。COI基因包含豐富的遺傳信息，既相對保守又能保證足夠變異，進(jìn)化速率適中，可作為屬種系統(tǒng)進(jìn)化研究的良好標(biāo)記，目前已廣泛應(yīng)用于昆蟲分子系統(tǒng)發(fā)育分析［3-6］。DNA條碼技術(shù)已為研究和利用地球上眾多的生物資源，鑒定生物多樣性提供了強(qiáng)大的工具，并在各物種的鑒定與分類中發(fā)揮重要作用［5-8］。

菱蠟蟬科Cixiidae隸屬于半翅目Hemiptera頭喙亞目 Auchenorrhyncha蠟蟬總科 Fulgoroidea，該科最早由Spinola(1839)建立，目前全世界已記錄172屬2048種［9］。該類群昆蟲不少種類為農(nóng)林生產(chǎn)重要害蟲［9-10］，近年來逐漸引起人們的重視和關(guān)注。Ceotto和Bourgoin［11］首次結(jié)合線粒體和核基因?qū)α庀炏s科進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析，研究基于來自 COI、Cytb、18S rDNA、28S rDNA(2 個(gè)非保守區(qū))基因的3652個(gè)堿基，結(jié)論是菱蠟蟬科與飛虱科互為姐妹群;葉文斌等［12］利用2個(gè)線粒體基因重建蠟蟬總科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，主要通過16S rDNA基因3′端400個(gè)堿基以及Cytb 5′端120個(gè)密碼子對來源于6科10個(gè)分類單元(16S rDNA基因是6科9個(gè)分類單元)進(jìn)行了研究;近年張培做了中國菱蠟蟬科系統(tǒng)分類研究［9］并描述了 4個(gè)新種［13-14］，其中基于16SrDNA對菱蠟蟬科30種進(jìn)行了分子系統(tǒng)發(fā)育分析，其結(jié)果均顯示，菱蠟蟬科組成一個(gè)單系群。

本文通過對菱蠟蟬亞科Cixiinae 9屬17種昆蟲的mtDNA CO I基因序列進(jìn)行研究，驗(yàn)證了DNA條形碼對菱蠟蟬亞科昆蟲的識別和鑒定是可行的，測定了22條COI基因序列，運(yùn)用MEGA 5對序列進(jìn)行比對和遺傳距離分析，基于COI基因序列構(gòu)建ML、MP 、NJ、ME系統(tǒng)發(fā)育樹，用以快速、準(zhǔn)確地鑒定菱蠟蟬亞科昆蟲種類，為進(jìn)一步研究菱蠟蟬科昆蟲分子鑒定技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

所用實(shí)驗(yàn)樣品分別采自貴州、云南、四川、廣西、福建等地，采集信息見表1。樣本置于1.5ml離心管用無水乙醇浸泡，于-20℃冰箱保存，供實(shí)驗(yàn)用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA提取 樣本經(jīng)解剖、鑒定、編號后，頭胸部用于DNA提取，腹部及特征結(jié)構(gòu)用于鑒定。采用北京天根TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒 (離心柱型)進(jìn)行基因組DNA提取，對所提取的DNA樣本采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

表1 供試樣本的采集信息Tab.1 Information of specimens involved in this study

1.2.2 PCR引物 CO I基因PCR擴(kuò)增使用的引物對是通用引物:引物由上海生工生物有限公司合成，CO I引物參考 Herbert［15］，所用引物具體情況見表2。

表2 PCR擴(kuò)增所用引物Tab.2 PCR primers

1.2.3 PCR反應(yīng)體系及條件 使用上海生工生物工程有限公司的2×Taq PCR MasterMix，每25μL反應(yīng)體系見表3。95℃預(yù)變性7min;95℃變性50 sec;50℃退火1min;72℃延伸1min;變性延伸重復(fù)循環(huán)數(shù)35 Cycles;72℃延伸10min。

表3 PCR反應(yīng)體系Tab.3 PCR reaction system

1.2.4 PCR產(chǎn)物測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。檢測時(shí)，上樣量4μL，電泳結(jié)果用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照(圖1)。PCR產(chǎn)物檢測條帶單一、明亮，產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測序。每個(gè)樣品采用正反雙鏈雙向測序，提高測序的準(zhǔn)確度。

圖1 COI基因PCR擴(kuò)增電泳檢測(DM1000 DNA MarkerⅡ)Fig.1 PCR detection of COIgene

1.3 外群的選擇及序列處理分析方法

根據(jù)Bourgoin等［15］分析了蠟蟬總科中7個(gè)科的18S rDNA序列，其結(jié)果顯示菱蠟蟬科+飛虱科是系統(tǒng)樹的最基部分支，并互為姐妹群，Yeh等［16］基于線粒體16S rDNA對蠟蟬總科進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示飛虱科與菱蠟蟬科互為姐妹群;Ceotto［11］等對菱蠟蟬科進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)外群也選定了飛虱科。本文遵循以上學(xué)者的觀點(diǎn)，選擇褐飛虱Nilaparvata lugens作為外群。

每個(gè)樣品經(jīng)測序均獲得各自的COI基因序列，在SeqMan軟件校對后確定準(zhǔn)確無誤后，在NCBI中進(jìn)行BLAST相似性檢索，確定目的基因片段。從GenBank下載褐飛虱Nilaparvata lugens序列1條作為系統(tǒng)發(fā)育分析外群。樣品序列22條，所用的COI序列共計(jì)23條。

采用MEGA 5對DNA序列進(jìn)行比對并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，計(jì)算序列的堿基組成、物種間遺傳距離、恒定位點(diǎn)(constant site)，變異位點(diǎn)(variation site)、簡約信息位點(diǎn)(pasimony informative site)、單突變位點(diǎn)(singleton site)、轉(zhuǎn)換堿基對(transitional pairs)。應(yīng)用鄰接法(NJ)、最小進(jìn)化法(ME)、和最大簡約法(MP)構(gòu)建系統(tǒng)樹，使用Kimura 2-parameter(K2P)模型，空位采用成對刪除(Pairwise Deletion)策略，自展檢驗(yàn)(Bootstrap)1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列組成和變異

序列組成分析結(jié)果顯示，17種菱蠟蟬線粒體DNA COI基因序列平均堿基組成為:A:31.9%、T:35.3%、C:18.2%、G:14.6%，A+T含量為67.2%，G+C的含量為32.8%，A+T含量明顯高于G+C的含量，表現(xiàn)明顯的A+T堿基偏嗜，且A與T含量相當(dāng)，符合昆蟲線粒體基因堿基組成的基本特征［17］。經(jīng)對比后得到COI序列長度為809 bp，其中保守位點(diǎn)C 118/809，變異位點(diǎn)v 606/809，簡約信息位點(diǎn)Pi381/809，自裔位點(diǎn)S 215/809。

2.2 堿基替換分析

使用Mega 5軟件，計(jì)算全體位點(diǎn)及各位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換與顛換值以及其比值，計(jì)算結(jié)果如表4所示，全體位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換主要發(fā)生在A與T之間，轉(zhuǎn)換/顛換比值(R)為0.74。密碼子第1，2和3位點(diǎn)R值分別為0.84，0.74和0.67。無論整體還是密碼子各位點(diǎn)，其R值均小于2，因此，該段序列轉(zhuǎn)換與顛換未達(dá)到飽和，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)考慮轉(zhuǎn)換和顛換的發(fā)生比率;且說明該段基因可靠度高，使用該基因得到的進(jìn)化樹可靠。COI序列核苷酸密碼子變異情況見表4。

表4 核苷酸堿基替換值Tab.4 Replacement value of nucleotide bases

2.3 遺傳距離分析

采用MEGA 5軟件基于最大復(fù)合概似法(maximum composite likelihood，MCL)模型和 Kimura-2-Parameter(K2P)雙參數(shù)模型，分析計(jì)算種間遺傳距離(表5)，結(jié)果表明，外群與22個(gè)樣本之間平均點(diǎn)位差異系數(shù)均小于0.05，差異顯著，外群與內(nèi)群種之間的進(jìn)化分歧最大為0.068，樣本與外群遺傳距離介于0.502～0.645;屬間平均遺傳距離為0.133介于0.102～0.147，屬內(nèi)種間平均遺傳距離為0.047，介于0.025～0.079之間;種內(nèi)地理類群間平均遺傳距離為0.039，介于0.024～0.064之間，此范圍與屬內(nèi)種間遺傳距離范圍有交集，地理種群間遺傳距離差異不明顯;擬甘肅印度菱蠟蟬Indolipa paragansuensis與基刺庫菱蠟蟬Kuvera basisipina之間的遺傳距離為最大為0.319。分析結(jié)果說明，屬間、種間遺傳距離差異較明顯，可將此段序列作為分析鑒別物種的依據(jù)。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

采用MEGA 5軟件基于最大簡約法(ML)、最大簡約法(MP)、鄰接法(NJ)和最小進(jìn)化法(ME)等構(gòu)建4棵系統(tǒng)樹(圖2～5)，構(gòu)建樹使用Kimura 2-parameter(K2P)模型，空位采用成對刪除(Pairwise Deletion)策略，自展檢驗(yàn)(Bootstrap)1000次，不同方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹基本相似。

表5 基于K imuraw2－parameter模型遺傳距離(下三角)和標(biāo)準(zhǔn)差(上三角)Tab.5 Kimuraw2－parameter model based on genetic distance(lower－triangle)and standard deviation(upper－triangle)

圖2 基于mt DNA COI基因ML法構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 ML phylogenetic tree based on m tDNA COI gene sequences

圖3 基于mt DNA COI基因MP法構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 MP phylogenetic tree based onmtDNA COIgene sequences

圖4 基于mt DNA COI基因NJ法構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 NJphylogenetic tree based on m tDNA COI gene sequences

圖5 基于mt DNA COI基因ME法構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 ME Phylogenetic tree based onmtDNA COIgene sequences

從圖2～5中可以看出:所得4棵系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)之間具有一致性的同時(shí)，也存在著一定的差異。盤突貝菱蠟蟬三個(gè)地理類群云南、廣西、貴州分別為三小支，聚為一支，置信度高達(dá)99、99、100，與南嶺貝菱蠟蟬 B.sp1和峨眉貝菱蠟蟬B.sp2聚為圓額菱蠟蟬族Semonini一支，圓額菱蠟蟬族的另一支庫菱蠟蟬屬四個(gè)種位于樹的下部，其中ML樹顯示K.ussuriensis和K.basisipina聚為一小支(其置信度高達(dá)100)，其再與香格里拉庫菱蠟蟬K.shangrilaensis聚為一支，韋氏庫菱蠟蟬K.wvibastei卻未與其聚在一支里，說明該種疏于本屬;大菱蠟蟬屬兩個(gè)種小斑大菱蠟蟬M.raimaculatus和碩大菱蠟蟬M.grossus聚為一小支(置信度高達(dá)100)與冊亨圓口菱蠟蟬Discophorellus cehengsis靠在一起組成菱蠟蟬族(Cixiini)，但菱蠟蟬族(Cixiini)中角突三脊菱蠟蟬Trihacus gracilisplinus位于樹的中下部遠(yuǎn)離該族，其與歐菱蠟蟬族(Eucarpiini)3個(gè)種、安菱蠟蟬族(Andini)安菱蠟蟬1個(gè)種共同聚為一支;五脊菱蠟蟬族(Pentastirini)兩個(gè)種基刺瑞脊菱蠟蟬Reptalus basiprocessus、擬甘肅印度菱蠟蟬Indolipa paragansuensis單獨(dú)聚為一支位于樹的中部;三叉安菱蠟蟬Andes sp與偏伊戴菱蠟蟬D.excentricus聚為一小支后與雙叉伊戴菱蠟蟬 Dilacreon(Eluzalmon)difurcatus、林氏黑帶菱蠟蟬Kirbyana lini、雙叉伊戴菱蠟蟬Dilacreon(Eluzalmon)difurcatu、角突三脊菱蠟蟬Trirhacus gracilisplinus聚為一大支，說明三叉安菱蠟蟬Andes sp與該幾個(gè)類群近緣。

由4棵系統(tǒng)樹可以看出，由同屬組成的一支置信度高，不同屬組成的一支置信度低，如庫菱蠟蟬屬(基刺庫菱蠟蟬K.basisipina、烏蘇里庫菱蠟蟬K.ussuriensis)一支、大菱蠟蟬屬(碩大菱蠟蟬、少斑大菱蠟蟬)一支、貝菱蠟蟬屬(盤突貝菱蠟蟬、南嶺貝菱蠟蟬)一支近緣程度高，置信度分別高達(dá)100%、99%和99%;近緣屬能聚在一起，但置信度偏低，最低時(shí)僅15%，這與屬間、種間、種內(nèi)遺傳距離分析結(jié)果具有一致性。雖然遺傳距離顯示地理種群間差異不明顯，并與種間的遺傳距離范圍有交集，但從系統(tǒng)發(fā)育樹上能明顯看出同一地理種群能聚在一支，且分支置信度高達(dá)98%～100%，說明地理種群之間也發(fā)生了遺傳分化。結(jié)果顯示:菱蠟蟬亞科是單系群，這與張培［9］基于16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果基本一致，與傳統(tǒng)分類學(xué)上的觀點(diǎn)一致，但安菱蠟蟬屬一支、庫菱蠟蟬屬一支與其發(fā)育樹中對應(yīng)位置存在一定的差異，有待進(jìn)一步研究。

3 討論

自Herbert等［1］以來，DNA條形碼在昆蟲分類中得到了廣泛應(yīng)用。近年來，DNA條形碼技術(shù)用于昆蟲種類鑒定的報(bào)道很多，如常虹等［4］基于線粒體COI基因?qū)X小蠧屬昆蟲進(jìn)行研究，結(jié)果表明其片段在種間平均遺傳距離為0.199;郭銳等［18］做了9種鶴類DNA條形碼研究，其研究表明9種鶴類的種間平均遺傳距離在0.124～1.218之間;黃麗莉等［19］利用COI基因?qū)喼抻衩酌?個(gè)不同地理類群進(jìn)行了研究分析，6個(gè)亞洲玉米螟地理種群的平均遺傳距離為0.012，分歧最大的為0.019，最小的為0.002。通過比較研究表明，利用COI序列進(jìn)行遺傳距離分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，并通過屬種間遺傳距離的分歧大小，可用于區(qū)分不同的物種，但利用線粒體COI基因DNA序列分歧來確定不同地理種群間是否存在差異目前尚無定論［20］，因此，在未來的研究中可采用不同的分子標(biāo)記方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

通過研究表明，菱蠟蟬亞科屬間平均遺傳距離為0.133介于0.102～0.147;屬內(nèi)種間平均遺傳距離為0.047，介于0.025～0.079之間;種內(nèi)地理種群間平均遺傳距離為0.039，介于0.024～0.064之間，范圍與屬內(nèi)種間遺傳距離范圍有交集，因此，地理種群間遺傳距離差異不明顯，但菱蠟蟬亞科昆蟲屬間、種間已經(jīng)發(fā)生較顯著的遺傳分化，該片段可以較好的區(qū)分菱蠟蟬科昆蟲不同物種，研究結(jié)果與Herbert等［16］研究理論一致?；?COI基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，同屬物種聚為一小支，分支置信度高達(dá)97%～100%;同一地理類群聚為一支，分支置信度高達(dá)98%～100%;近緣屬、種能聚在一起，但置信度偏低，這與屬間、屬內(nèi)種間、種內(nèi)遺傳距離分析結(jié)果具有一致性。系統(tǒng)發(fā)育樹也表明地理種群的進(jìn)化與地理距離存在一定的相關(guān)性，雖然遺傳距離顯示同種物種間地理差異不明顯，種間和種內(nèi)遺傳距離范圍有交集部分，但是從系統(tǒng)發(fā)育樹上能明顯看出同一地理類群種能聚在一支，且分支置信度高，說明地理類群之間也發(fā)生了一定的遺傳分化。所得系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果基本一致，遺傳距離分析等顯示該片段基因序列能夠區(qū)分菱蠟蟬亞科不同物種，因此，應(yīng)用基于COI基因片段的DNA條形碼對菱蠟蟬亞科昆蟲分類鑒定是可行的。

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