李婭迪，江 輝，沈文華，孫園園，關(guān) 萍

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550025)

砷在自然界中分布極為廣泛，與人類的生活密切相關(guān)，在全球經(jīng)濟(jì)化的加速發(fā)展下，各種含砷污染物以不同形式進(jìn)入土壤，造成土壤砷的污染日益嚴(yán)重。砷化合物多數(shù)對(duì)人、畜、禽有很強(qiáng)的毒性，可致病、致畸、致突變和致腫瘤等。當(dāng)人體攝入砷超過一定劑量時(shí)就會(huì)引起急性或慢性中毒，如長(zhǎng)期飲用含砷量0.8 mg/L的水或每日進(jìn)食中含砷近3 mg達(dá)2～3周便可引起中毒［1］。砷已被國(guó)內(nèi)外列為優(yōu)先污染物，在我國(guó)污灌引起的土壤污染中，砷居第5位［2］。目前，砷污染對(duì)植物生長(zhǎng)的影響研究主要集中在農(nóng)作物，如水稻、小麥、玉米等均有研究，但在花卉方面的研究則較少。種子萌發(fā)作為植物生活期的起點(diǎn)及感知外界環(huán)境變化的最初生命階段，為評(píng)價(jià)植物對(duì)重金屬耐受性高低的重要階段。本文以2種常見花卉種子為材料，研究不同As3+濃度處理下對(duì)種子萌發(fā)影響;幼苗生長(zhǎng)及幼苗抗氧化酶活性變化情況，以期探究As3+對(duì)植物傷害的機(jī)理，研究可為已污染土壤進(jìn)行花卉種植種類的篩選，及耐砷脅迫花卉的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選用的茶花鳳仙(Impatiens balsamena)、常夏石竹(Dianthus plumarius)花卉種子，購(gòu)買北京市芳萱苑種子有限公司;藥品As2O3為分析純。

1.2 方法

1.2.1 種子的處理 采用紙上發(fā)芽的方式［3］。用去離子水將As2O3配制成濃度分別為0、0.1、5、10、25、50 mg/L的As3+溶液，0為對(duì)照。選擇飽滿的花卉種子，0.1%的HgCl2消毒4～5 min，去離子水沖洗5次，之后用不同濃度的As3+溶液浸種24 h。將浸泡過的種子取出放入培養(yǎng)皿內(nèi)(50粒/培養(yǎng)皿)，重復(fù)3次。22℃溫箱中培養(yǎng)，每天進(jìn)行等量相應(yīng)濃度的砷溶液補(bǔ)充蒸發(fā)的水分，并觀察記錄發(fā)芽種子數(shù)。培養(yǎng)10 d后，取幼苗進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 測(cè)定方法 以種子露白為第1天開始記錄，觀察每日種子萌發(fā)的情況，并按以下公式計(jì)算發(fā)芽指標(biāo)［4］。

發(fā)芽勢(shì)=前4d正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%;

發(fā)芽率=前7d正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%;

芽指數(shù)=∑(Gt/Dt);

其中，Gt為t時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

培養(yǎng)10 d后，將已萌發(fā)的種子取出，濾紙吸干水分，測(cè)量其根長(zhǎng)，芽長(zhǎng)及鮮重，每個(gè)培養(yǎng)皿中取10株進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果取其平均值?？寡趸富钚缘臏y(cè)定:超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定為NBT光還原法［5］，過氧化物酶(POD)活性測(cè)定為愈創(chuàng)木酚法［6］，過氧化氫(CAT)測(cè)定為紫外吸收光譜法［5］。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用 Excel和 DPS(v7.05)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同的As3+濃度脅迫對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響

不同的As3+濃度處理對(duì)2種花卉種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響是不同的(圖1和圖2)。增加低濃度As3+下(0.1 mg/L)，對(duì)種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率都起到了促進(jìn)作用，2種花卉的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均達(dá)到了最高值，分別為87%、93%和56%、72%。在砷濃度逐漸增加的情況下，種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率隨之下降，呈現(xiàn)明顯的抑制作用。結(jié)果表明:低濃度(0.1 mg/L)As3+可以促進(jìn)花卉種子發(fā)芽勢(shì)力、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù);茶花鳳仙在濃度達(dá)到25 mg/L時(shí)，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率出現(xiàn)顯著抑制作用，而常夏石竹在10 mg/L時(shí)呈現(xiàn)顯著抑制。茶花鳳仙和常夏石竹在As3+脅迫下，抑制作用隨著濃度的升高而加強(qiáng);濃度達(dá)50 mg/L時(shí)，部分種子有不萌發(fā)且壞死的現(xiàn)象。

圖1 砷脅迫對(duì)2種花卉種子發(fā)芽勢(shì)的影響Fig.1 Effect of arsenic stress on seed germination potential of two ornamental plants

圖2 As3+脅迫對(duì)2種花卉種子發(fā)芽率的影響Fig.2 Effect of arsenic stress on seed germination rate of two ornamental plants

2.2 As3+脅迫對(duì)2種花卉種子發(fā)芽指數(shù)的影響

由圖3可知，不同質(zhì)量濃度As3+對(duì)2種花卉種子的發(fā)芽指數(shù)存在顯著差異，均表現(xiàn)為隨著As3+溶液濃度的不斷增加，發(fā)芽指數(shù)不斷降低趨勢(shì)，且波動(dòng)幅度明顯。其中茶花鳳仙在 As3+濃度為10mg/L時(shí)，發(fā)芽指數(shù)仍高達(dá)72%，顯示出較高的耐砷性。常夏石竹種子在As3+(5 mg/L)時(shí)，發(fā)芽指數(shù)下降為34%，As3+(10 mg/L)下降到20%。因此從發(fā)芽指數(shù)看，茶花鳳仙耐砷性高于常夏石竹。

2.3 As3+脅迫對(duì)2種花卉幼苗生長(zhǎng)的影響

由表1可見，隨著As3+濃度的升高，2種花卉幼苗的根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)及鮮重均降低。空白試驗(yàn)組As3+(0 mg/L)2種花卉根長(zhǎng)分別為3.6 cm、1.8 cm;當(dāng) As3+濃度為 0.1、5、10、25、50 mg/L 時(shí)，茶花鳳仙根長(zhǎng)降幅分別55%、78%、84%、92%、98%，常夏石竹根長(zhǎng)降幅分別為59%、71%、85%、89%、95%。低濃度對(duì)2種花卉根長(zhǎng)呈明顯抑制作用，隨著As3+濃度的增加顯著增大。2種花卉的芽長(zhǎng)在As3+脅迫下的生長(zhǎng)抑制變化情況與根長(zhǎng)相似，呈現(xiàn)出比對(duì)照顯著下降的趨勢(shì)，分別為下降27%、38%、47%、56%、98% 和 15%、24%、42%、53%、97% ，As3+(0.1－25 mg/L)時(shí)芽長(zhǎng)降幅波動(dòng)不及根長(zhǎng)，As3+(50 mg/L)時(shí)，根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)降幅極其顯著。同時(shí)，隨著砷濃度增大，2種花卉的鮮重均受到抑制，抑制程度茶花鳳仙比常夏石竹在各處理濃度間呈顯著差異。As3+低濃度(0.1 mg/L)處理下，種子根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、鮮重均為顯著抑制，且隨著濃度升高而加強(qiáng)，當(dāng)As3+處理濃度＞10 mg/L時(shí)，茶花鳳仙的幼根開始變黃發(fā)黑變細(xì)，側(cè)根數(shù)明顯減少，且在50 mg/L時(shí)，其根已全部退化，常夏石竹則表現(xiàn)為幼根明顯變短，發(fā)黑;幼芽不同程度失綠。

圖3 As3+脅迫對(duì)2種花卉種子發(fā)芽指數(shù)的影響Fig.3 Effect of arsenic stress on seed germination index of two ornamental plants

表1 不同濃度As3+處理對(duì)2種花卉幼苗生長(zhǎng)的影響Tab.1 Effect of As3+concentration on seedling growth of two ornamental plants

2.4 As3+脅迫下2種花卉幼苗抗氧化酶的影響

2.4.1 As3+脅迫下幼苗CAT活性的影響 CAT具有清除細(xì)胞內(nèi)過量的過氧化氫，將其分解為H2O等物質(zhì)的功能［7］。本試驗(yàn)研究表明(見圖4)，砷脅迫處理后，2種花卉幼苗CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，茶花鳳仙在濃度5 mg/L時(shí)CAT活性最高，0.1 mg/L時(shí)常夏石竹CAT活性達(dá)到最高，與對(duì)照相比分別上升了68.6%和70%;低濃度As3+對(duì)CAT活性有激活效應(yīng)，但隨著濃度不斷升高(As3+≥50 mg/L時(shí))，CAT活性受到抑制，并出現(xiàn)低于對(duì)照組的現(xiàn)象。這表明低濃度砷脅迫下，2種花卉體內(nèi)產(chǎn)生了過多的過氧化氫，作為一種防御系統(tǒng)，通過提高CAT活性清除過氧化氫，當(dāng)濃度超過極限，CAT活性隨著過氧化氫明顯增加而降低，過多的過氧化氫會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成損傷，降低了細(xì)胞防御活性。

2.4.2 As3+脅迫下幼苗SOD的影響 SOD可以通過清除體內(nèi)的氧自由基來保護(hù)生物膜，防止生物膜脂過氧化。因此，其活性大小與逆境生長(zhǎng)下的植物密切相關(guān)［7］。由圖5結(jié)果可以看出，As3+對(duì)2種花卉幼苗SOD活性的總體影響與CAT活性變化相似。低濃度脅迫2種花卉都具有激活效應(yīng)(茶花鳳仙As3+≤5mg/L、常夏石竹As3+≤0.1 mg/L時(shí))，并分別于0.1 mg/L、5 mg/L時(shí)達(dá)到最大值，且為對(duì)照的288%和88.4%。隨著濃度增大，SOD活性受到明顯抑制作用，低于對(duì)照(As3+≥50 mg/L)。從圖4可知，兩種植物SOD對(duì)砷脅迫敏感性不同，常夏石竹在As3+5和25 mg/L時(shí)，SOD活性仍高于對(duì)照組，所呈現(xiàn)敏感性為:常夏石竹＞茶花鳳仙。

圖4 不同濃度As3+處理對(duì)兩種花卉幼苗過氧化氫酶活性的影響Fig.4 Effect of As3+concentration on CAT activity of two ornamental plants

圖5 不同濃度As3+處理對(duì)兩種花卉幼苗超氧化物歧化酶活性的影響Fig.5 Effect of As3+concentration on SOD activity of two ornamental plants

2.4.3 As3+脅迫下幼苗POD的影響 POD是存在于葉綠體中專一的抗壞血酸過氧化物酶，通過將過氧化氫分解為水等物質(zhì)，減輕其對(duì)植物體的傷害，POD活性的變化作為反映植物承受逆境脅迫下傷害程度的一個(gè)重要指標(biāo)［8］，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖6)，茶花鳳仙與常夏石竹幼苗POD活性在低濃度下被激活，并隨著濃度的不斷升高，POD活性逐漸增大，與對(duì)照相比，當(dāng) As3+濃度為 0.1、5、10、25、50 mg/L時(shí)，增幅分別為58%、114%、187%、247%、335% 和 85% 、267% 、187% 、320% 、322% 。

3 結(jié)論與討論

圖6 不同濃度As3+處理對(duì)兩種花卉幼苗過氧化物酶活性的影響Fig.6 Effect of As3+concentration on POD activity of two ornamental plants

砷脅迫處理對(duì)茶花鳳仙和常夏石竹種子萌發(fā)具有低濃度下的刺激效應(yīng)和高濃度下的抑制作用，對(duì)幼苗根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)及鮮重有著極顯著地抑制效應(yīng)，且抑制作用隨著砷濃度的增加而增強(qiáng)。砷脅迫下種子萌發(fā)過程的形態(tài)表現(xiàn)為，茶花鳳仙側(cè)芽生長(zhǎng)受抑制，根數(shù)減少，根長(zhǎng)明顯變短，隨著濃度升高，根變褐發(fā)黑，甚至退化等現(xiàn)象;常夏石竹芽生長(zhǎng)受抑制，根長(zhǎng)明顯變短。而這些外部形態(tài)的變化與植物內(nèi)源抗氧化酶變化密切相關(guān)的。在神脅迫處理下，通常植物會(huì)產(chǎn)生高度反應(yīng)性的自由基，引起生物膜的過氧化損傷，造成多種線粒體、微體等細(xì)胞器的損害，最終導(dǎo)致程序性死亡。而植物體內(nèi)也有一套復(fù)雜的清除活性氧的系統(tǒng)，以此來保護(hù)植物細(xì)胞免受傷害?；钚匝跚宄到y(tǒng)包括抗氧化劑(谷胱甘肽、脯氨酸等)以及抗氧化酶類(POD、SOD、CAT等)。外源脅迫初期，植物體內(nèi)的活性氧清除系統(tǒng)被激活，來防御活性氧對(duì)植物的損傷作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度砷脅迫下，2種花卉幼苗抗氧化酶活性(SOD、CAT和POD)呈現(xiàn)出激活效應(yīng)，但隨著砷濃度升高，SOD、CAT酶激活表現(xiàn)出抑制效應(yīng);POD活性則隨著濃度增激活效應(yīng)增強(qiáng)。三種抗氧化酶均可被激活來抵抗砷的脅迫，但其中過氧化物酶(POD)起關(guān)鍵作用，這是因?yàn)榭寡趸到y(tǒng)內(nèi)多種酶之間活性比的不平衡，但由于酶的活性有一定的閥值，當(dāng)As3+濃度增大到一定濃度，POD活性也會(huì)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這表明抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)脂膜系統(tǒng)的保護(hù)作用是有一定限度的。

種子萌發(fā)的質(zhì)量好壞對(duì)植物的生長(zhǎng)和生物量具有直接影響，因而研究種子萌發(fā)階段對(duì)重金屬污染的耐受性具有重要的意義。砷是一種毒性很強(qiáng)的環(huán)境污染物。一般認(rèn)為，砷不是植物的必需營(yíng)養(yǎng)元素不同農(nóng)作物對(duì)砷的忍耐性差異很大，表現(xiàn)為旱生作物對(duì)砷的忍耐性大于禾谷類作物水生作物大于豆類和蔬菜作物［8］。而關(guān)于花卉植物對(duì)砷耐性研究較少，植物修復(fù)作為一種重要的修復(fù)措施，目前已廣為接受，其中花卉植物因美化環(huán)境的重要功能而被人們推崇，本文以此出發(fā)，研究了2種花卉植物種子在As3+脅迫下的萌發(fā)，初探砷在花卉植物中耐性，由于實(shí)驗(yàn)空間較小，與外界生長(zhǎng)環(huán)境等因素有一定的差異。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果只能初步說明兩種以及不同處理之間的差異，為該領(lǐng)域的研究提供新的基礎(chǔ)研究材料。

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