徐世燕，龍見坤，楊 琳，陳祥盛，3*

(1.貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴州 貴陽 550025;2.昆蟲資源開發(fā)利用省級(jí)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025;3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

優(yōu)穎蠟蟬屬Eudeferunda和卡穎蠟蟬屬Caristianus隸屬于半翅目 Hemiptera蠟蟬總科 Fulgoroidea穎蠟蟬科 Achillidae［1］。優(yōu)穎蠟蟬屬 Eudeferunda 系 Chen，Yang ＆ Wilson(1989)［2］以采自臺(tái)灣的Eudeferunda lenita為模式種所建立［3］，該屬迄今僅記述2種，即中等優(yōu)穎蠟蟬Eudeferunda lenita和刺突優(yōu)穎蠟蟬 Eudeferunda alatea［3］，分別分布于我國(guó)臺(tái)灣和海南?？ǚf蠟蟬屬Caristianus系Distant(1916)［5］以采自斯里蘭卡的 Caristianus indicus為模式種所建立［3］，該屬現(xiàn)共記述13種，主要分布于中國(guó)，斯里蘭卡，印度和日本。

優(yōu)穎蠟蟬屬和卡穎蠟蟬屬的形態(tài)特征有許多的相似之處，如:頭頂略傾斜，中域凹陷，中脊端部不明顯，前緣明顯突出，側(cè)緣強(qiáng)脊?fàn)?，后緣凹?前翅長(zhǎng)約為寬的3倍;優(yōu)穎蠟蟬觸角梗節(jié)近似球形，卡穎蠟蟬觸角梗節(jié)近似球形;其雄性外生殖器尾節(jié)側(cè)面觀腹緣長(zhǎng)于背緣，前緣凹入，后緣突出具端部1曲指向下的短突，腹面觀腹中突成對(duì)，中裂縫深，陽基側(cè)突背緣具1只向外側(cè)的三角形大突;陽莖側(cè)刺突端部細(xì)長(zhǎng)。兩者主要區(qū)別在于優(yōu)穎蠟蟬額面基部凹陷，單眼遠(yuǎn)離復(fù)眼，前胸背板具有明顯的側(cè)脊區(qū)域，前翅Sc+R交叉與Cu交叉在同一水平，后足脛節(jié)基部2/5具側(cè)刺;卡穎蠟蟬額面基部呈片狀突起，單眼靠近復(fù)眼，前胸背板沒有側(cè)脊區(qū)域，前翅Sc+R在基部1/4出分叉，Cu1分叉在爪片端部，后足脛節(jié)側(cè)刺位于基部1/3至中部。

由于卡穎蠟蟬與優(yōu)穎蠟蟬在形態(tài)及雄性外生殖器上比較相似，本研究利用16S rDNA進(jìn)行序列比對(duì)，遺傳距離分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，來探討優(yōu)穎蠟蟬屬與卡穎蠟蟬屬的分類地位。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試標(biāo)本 供試標(biāo)本為近年來采自貴州、山西、四川、福建的代表種類，用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本材料保存于無水乙醇中，相關(guān)信息見表1，其雄蟲外生殖器保存于甘油中。

表1 供試穎蠟蟬標(biāo)本Tab.1 Achilidae sam ples involved in this study

1.1.2 儀器設(shè)備 光學(xué)體視顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，UVP凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)鑒定 在光學(xué)體視顯微鏡下按照常規(guī)方法［6］對(duì)其進(jìn)行觀察、解剖與鑒定，并在繪圖儀上繪制部分主要雄性外生殖器特征圖，如圖1(AD)和圖2(E-L)所示。

1.2.2 基因組DNA的提取 將保存于無水乙醇中的標(biāo)本用無菌雙蒸水沖洗干凈，實(shí)驗(yàn)前用STE溶液侵泡標(biāo)本過夜［7］，后將供試蟲體水分吸干并將其研磨至無明顯組織塊，用基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，溶解在TE中，測(cè)定濃度后調(diào)整為1～2 ng/μL，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 穎蠟蟬雄性成蟲背面觀Fig.1 Male habitus of achilid species，dorsal view

圖2 穎蠟蟬生殖節(jié)腹面觀;右陽基側(cè)突背面觀Fig.2 Male genitalia of achilid species，ventral view;right genital style，dorsal view

1.2.3 16S rDNA的PCR擴(kuò)增 用于擴(kuò)增16S rDNA序列的DNA模板采用上海生工UNIQ-10柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒提取得到;PCR擴(kuò)增引物參考［8］，引物序列為:PF(5‘-GCCTGTTTATCAAAAACAT-3 ′)，PR(5’-CCGGTCTGAACTCAGATCA-3′)，引物由上海生物工程公司合成，PCR擴(kuò)增體系為25μL，內(nèi)含10mmol/L Tris(pH 8.3)，50 nmol/L KCl，0.01%Triton X-100，2.0mmol/L MgCl2，0.2mmmmol/L dNTPs，0.2mmol/L引物，1.0 U Taq酶以及1ul DNA模版。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性7 min;95℃變性50 s，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其片段大小、純度及含量。

1.2.4 16S rDNA的測(cè)序 樣品經(jīng)鑒定合格后送華大基因生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序儀為ABIPRISMTM 3730XL DNA Analyzer，反應(yīng)試劑為BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)。

1.2.5 序列分析及分子系統(tǒng)樹的重建 利用Chromas、DNAStar以及Clustal2.0等軟件對(duì)測(cè)序得到的序列進(jìn)行拼接、比對(duì)、編輯等分析;通過Mega 5.05軟件分析個(gè)物種間16S rDNA基因的堿基組成、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和遺傳距離等。Magadha、Akotropis和Eudeferunda都?xì)w屬于Plectoderini。由于安可穎蠟蟬與優(yōu)穎蠟蟬在形態(tài)上比較相似，故系統(tǒng)發(fā)育以安可穎蠟蟬為外群，計(jì)算遺傳距離矩陣，選擇P-distance進(jìn)化模式及成對(duì)刪除位點(diǎn)(Pairwise deletion)進(jìn)行分析;通過Mega5.05中鄰接法(Neighbor-joiningmethod，NJ)和最大簡(jiǎn)約法建樹(Maximum parsimony，MP)重建分子系統(tǒng)樹，并通過Bootstrap1000次自舉檢驗(yàn)系統(tǒng)樹中各結(jié)點(diǎn)的置信值。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿基組成及序列變異

利用Mega5.05軟件對(duì)本研究中獲得的16S rDNA序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明:共有493個(gè)位點(diǎn)，其中，A、T、C、G 含量分別為 40.3%、30.1%、18.2%、11.4%，A+T的平均含量為70.4%，G+C的平均含量為20.4%;共檢測(cè)到變異位點(diǎn)277個(gè)，其中，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)68個(gè)，自裔位點(diǎn)209個(gè)，約占總序列的56.2%。

2.2 遺傳距離

利用Mega5.05軟件計(jì)算不同種類代表個(gè)體的16S rDNA序列間的遺傳距離(表2)，結(jié)果表明:內(nèi)群種間的遺傳距離為0.165～0.458(紫陽卡穎蠟蟬與佛坪卡穎蠟蟬遺傳距離為0.165;紫陽卡穎蠟蟬與茂蘭卡穎蠟蟬遺傳距離為0.458;佛坪卡穎蠟蟬與茂蘭卡穎蠟蟬遺傳距離為0.414);內(nèi)群屬間的遺傳距離為0.038～0.418(卡穎蠟蟬屬與優(yōu)穎蠟蟬屬的遺傳距離為0.038～0.418，佛坪卡穎蠟蟬、紫陽卡穎蠟蟬與刺突優(yōu)穎蠟蟬的遺傳距離為0.038和0.155，茂蘭卡穎蠟蟬與刺突優(yōu)穎蠟蟬的遺傳距離為0.418);內(nèi)群與外群之間的遺傳距離為0.134～0.446(紫陽卡穎蠟蟬與煙翅安可穎蠟蟬遺傳距離為0.211;佛坪卡穎蠟蟬與煙翅安可穎蠟蟬遺傳距離為0.134;茂蘭卡穎蠟蟬與煙翅安可穎蠟蟬遺傳距離為0.446);外群即煙翅安可穎蠟蟬和波斑馬穎蠟蟬屬間遺傳距離為0.138。

表2 穎蠟蟬16S rDNA序列的遺傳距離Tab.2 16S rDNA genetic distance of Achilidae

2.3 系統(tǒng)發(fā)育

利用Mega 5.05軟件基于不同種類代表個(gè)體的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3和圖4)，以煙翅安可穎蠟蟬作為外群，利用自展法(bootstrap)進(jìn)行置信度檢驗(yàn)。結(jié)果表明，卡穎蠟蟬屬的三個(gè)種聚在一起;刺突優(yōu)穎蠟蟬與佛坪卡穎蠟蟬聚在一起，而且置信值高達(dá)100%;與波斑馬穎蠟蟬的親緣關(guān)系較近，煙翅安可穎蠟蟬與其他5種穎蠟蟬的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 穎蠟蟬科16S rDNA基因序列進(jìn)化樹(MP tree)Fig.3 Maximum parsimony tree of Achilid 16S rDNA gene

圖4 穎蠟蟬科16S rDNA基因序列進(jìn)化樹(NJ tree)Fig.4 Neighbor-joining tree for 16S rDNA gene of Achilid

3 討論

3.1 屬間親緣關(guān)系

鑒于形態(tài)學(xué)鑒定方法的不足之處，本研究結(jié)合了分子生物學(xué)的方法對(duì)卡穎蠟蟬屬與優(yōu)穎蠟蟬屬進(jìn)行了研究。通過對(duì)其16S rDNA序列的比對(duì)、序列組成成份分析、遺傳距離分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的研究表明優(yōu)穎蠟蟬屬與卡穎蠟蟬屬兩者差異很小，從遺傳距離分析結(jié)果來看，卡穎蠟蟬屬與優(yōu)穎蠟蟬屬的遺傳距離為0.038～0.418。其中，值得注意的是:佛坪卡穎蠟蟬、紫陽卡穎蠟蟬與刺突優(yōu)穎蠟蟬的遺傳距離為0.038和0.155。另外，從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹來看，MP法和NJ法均顯示馬穎蠟蟬屬與卡穎蠟蟬屬和優(yōu)穎蠟蟬屬為姐妹群;其親緣關(guān)系較安可穎蠟蟬屬近;刺突優(yōu)穎蠟蟬與佛坪卡穎蠟蟬屬聚在一起，且置信值高達(dá)92%和100%(圖4和圖5)。結(jié)果表明，優(yōu)穎蠟蟬屬并不能獨(dú)立構(gòu)成一個(gè)單系群。另外文中所描述的刺突優(yōu)穎蠟蟬Eudeferunda alatea新種近似于屬模中等優(yōu)穎蠟蟬Eudeferunda lenita，但區(qū)別于后者在:中胸背板深褐色，僅在中域端角處黃褐色(后者中域乳白色);前翅延翅前緣具3個(gè)乳白的斑點(diǎn)(后者在翅前緣、Sc+R脈和翅痣之間乳白色);肩板具若干細(xì)小的縱脊(后者無);尾節(jié)腹中突端部明顯變細(xì)并端指向外側(cè)方(后者腹中突端向漸細(xì));肛節(jié)背面觀基緣微波狀兩側(cè)尖角狀后者基緣近直，兩側(cè)鈍凸);陽莖基底兩側(cè)在基部1/3處各具1尖的刺狀突(后者則在近端部)。故本研究結(jié)果建議將優(yōu)穎蠟蟬屬與卡穎蠟蟬屬合并為一個(gè)屬。

3.2 屬內(nèi)親緣關(guān)系

迄今為止，卡穎蠟蟬屬共記錄13種，本研究中涉及了卡穎蠟蟬屬的3個(gè)種，即紫陽卡穎蠟蟬、佛坪卡穎蠟蟬和茂蘭卡穎蠟蟬，其中，從雄性外生殖器的結(jié)構(gòu)來看，茂蘭卡穎蠟蟬與紫陽卡穎蠟蟬、佛坪卡穎蠟蟬最大的區(qū)別在于茂蘭卡穎蠟蟬的腹中突腹面觀側(cè)緣具刺狀突起，右陽基側(cè)突背面觀具有一個(gè)明顯的溝狀突起。由此可看出茂蘭卡穎蠟蟬和其他兩種卡穎蠟蟬的差別比較大，但可能是這里所選的代表種的不全面體現(xiàn)在雄性外生殖器上的差異。另外，紫陽卡穎蠟蟬(I1)與佛坪卡穎蠟蟬(K4)的遺傳距離為0.165，而茂蘭卡穎蠟蟬(M3)與紫陽卡穎蠟蟬(I1)和佛坪卡穎蠟蟬(K4)分別為0.458和0.414，后者的遺傳距離已經(jīng)超過了屬內(nèi)的遺傳距離(0.232)，具體的原因還有待于更加深入的研究。但是從系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果上看，卡穎蠟蟬屬的三個(gè)種都聚在一起，這又驗(yàn)證了茂蘭卡穎蠟蟬在形態(tài)學(xué)上的分類地位。

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