周佳平，林新春，徐英武

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

擬南芥SEPALLATA3蛋白質(zhì)原核表達(dá)與純化

周佳平，林新春，徐英武

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

SEPALLATA3（SEP3）屬于花器官建成ABCE模型中的E類基因，為了揭示SEP3蛋白是如何形成多聚體的，以及多聚體與其生物學(xué)功能之間的聯(lián)系，開展了擬南芥Arabidopsis thalianaAtSEP3蛋白質(zhì)體外可溶性表達(dá)實驗，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并在大腸埃希菌Escherichia coli細(xì)胞中進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。從蛋白不同的結(jié)構(gòu)域、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度等方面對蛋白的可溶性表達(dá)進(jìn)行了分析。最后以pET-15b為表達(dá)載體，大腸埃希菌表達(dá)菌株E. coli‘Rosetta’為宿主菌株，22℃誘導(dǎo)表達(dá)15 h，獲得不同片段的AtSEP3可溶性蛋白。通過鎳柱及分子層析色譜柱分離純化，表明AtSEP3蛋白以四聚體形式存在。圖4參13

植物學(xué)；SEP3蛋白；原核表達(dá)；蛋白純化；多聚體

花器官的研究一直以來是植物發(fā)育學(xué)研究中的一大熱點。1991年Coen等［1］在擬南芥Arabidopsis thaliana和金魚草Antirrhinum majus的花器官同源異型突變體的遺傳學(xué)研究基礎(chǔ)上，首先提出了“ABC”模型，隨后Theiβen等［2］又陸續(xù)提出了有關(guān)植物花發(fā)育的新模型，即“ABCD”模型、“ABCDE”模型及四元體模型。目前，對于酵母MCMI-擬南芥AG-金魚草DEFA-動物血清應(yīng)激因子SRF（MADS）轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在它們的遺傳學(xué)功能［3］及其植物新陳代謝調(diào)控方面［4］。通過對擬南芥突變體的研究，證明SEPALLATA-like基因?qū)τ诨ǚ鄣某墒旒盎ǚ酃艿男纬捎兄匾饔茫?］。SEP-like基因是編碼MADS蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，在雙子葉植物中基因的功能表現(xiàn)出不同程度的冗余性和亞功能化［5］，E類開花基因的同源蛋白在花器官的發(fā)育形成方面比其他A/B/C類轉(zhuǎn)錄因子更重要［6-7］。SEP3屬于E類的擬南芥AGL9型基因，編碼蛋白在MADS box家族形成四聚體復(fù)合物過程中起著重要作用［6］。MADS蛋白在開花過程中主要通過與其他蛋白互作［8］，參與了許多調(diào)控開花過程［9］。SEP3蛋白是否只是在結(jié)合其他轉(zhuǎn)錄因子后形成異聚復(fù)合物［10］時才發(fā)揮作用，還是在形成同源多聚體后也有生物學(xué)功能，目前尚不清楚。已有的研究證明：MADS蛋白與特異的DNA結(jié)合形成同源多聚體并行使其功能［11］，但SEP3蛋白同源多聚體形成的作用機(jī)制及其與功能之間的關(guān)系，至今還沒有明確的答案。本研究嘗試通過體外表達(dá)純化可溶性SEP3蛋白的途徑加以分析，將不同結(jié)構(gòu)域的AtSEP3基因，克隆到原核表達(dá)載體pET-15b上，誘導(dǎo)表達(dá)后篩選獲得可溶性表達(dá)，純化獲得高質(zhì)量的AtSEP3蛋白。這項工作為通過AtSEP3蛋白的結(jié)構(gòu)功能解析來分析植物花形成分子機(jī)制提供了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

哥倫比亞（Columbia，Col）野生型擬南芥由浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地實驗室栽植。大腸埃希菌Escherichia coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，表達(dá)菌株E.coli‘Rosetta’以及表達(dá)質(zhì)粒pET-15b為浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地保存；RNA提取試劑盒購自北京鼎國昌盛有限公司；DNA聚合酶、各種DNA限制性內(nèi)切酶及DNA購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA連接酶購自New England公司；DNA純化試劑盒、膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其余各試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 AtSEP3原核表達(dá)載體的構(gòu)建 用Trizol法提取擬南芥花芽組織RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)擬南芥的SEP3基因的cDNA保守序列設(shè)計2個不同結(jié)構(gòu)域（包括MIKC域，IKC部分）的引物，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物連接到pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α后取樣測序。將測序驗證正確的菌株擴(kuò)大提取質(zhì)粒后，用NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切提取的質(zhì)粒和pET-15b載體，DNA膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物后將片段和載體16℃過夜連接后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α并涂布氨芐抗性的LB平板上，挑菌培養(yǎng)后菌液PCR檢測，并送菌樣品測定堿基序列，克隆得到不同結(jié)構(gòu)域片段的AtSEP3原核表達(dá)載體。

1.2.2 重組AtSEP3蛋白的可溶性條件篩選 不同的誘導(dǎo)溫度對于原核表達(dá)蛋白的可溶性有密切的關(guān)系，高溫條件下菌株快速表達(dá)目的蛋白容易使蛋白形成不正確的構(gòu)象折疊最后以包涵體的形式存在，不利于獲得可溶性的蛋白。測序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于表達(dá)宿主菌株E.coli‘Rosetta’中，37℃培養(yǎng)15.0 h，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到100.0 mL的含50.0 mg·L-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，培養(yǎng)3.0 h，菌液濃度在吸光度D（λ）600為0.4～0.6時，加入終濃度為0.1 mmol·L-1的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），分別在37℃，5.0 h和22℃，15.0 h不同的溫度及時間條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)。確定適合誘導(dǎo)的培養(yǎng)溫度。

1.2.3 AtSEP3重組蛋白的多肽指紋圖譜驗證 上述純化得到的重組蛋白經(jīng)聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDSPAGE）分離檢測，考馬斯亮藍(lán)染色后，用手術(shù)刀小心切取目的條帶，置于1.5 mL離心管中（加入小量雙蒸水ddH2O），由北京信科奧達(dá)科技有限公司做肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定分析。

1.2.4 重組AtSEP3蛋白的純化 使用Ni-TNA樹脂初步純化后用凝膠過濾層析柱純化可溶性的融合蛋白。具體步驟如下：5 000 g離心收集菌液沉淀，加入10.0 mL 0.5 mol·L-1氯化鈉，20.0 mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）pH 8.0的裂解液，冰水下功率為200 W，5 s開8 s關(guān)超聲10.0 min，靜置30.0 min后4℃條件17 000 r·min-1離心40.0 min。收集上清液，平衡好Ni-NTA柱，將上清液上柱，在冰上用搖床緩慢結(jié)合30.0 min后，收集未特異性結(jié)合Ni-NTA柱的雜蛋白，分別用10個柱體積的不同咪唑濃度梯度的緩沖液（4/20/80 mmol·L-1咪唑，0.2 mol·L-1氯化鈉，20.0 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0）洗脫非特異性結(jié)合的雜蛋白，最后用10倍體積的洗脫溶液（200.0 mmol·L-1咪唑，0.2 mol·L-1氯化鈉，20.0mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0）沖洗收集目的蛋白。使用凝膠過濾層析柱純化目的蛋白。將收集的洗脫液用超濾濃縮柱4 000 g離心濃縮至500.0 μL體積后上樣，以洗脫緩沖液（0.2 mol·L-1氯化鈉，20.0 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0），0.5 mL·min-1流速分離純化目的蛋白。取小量蛋白樣品加入2倍蛋白上樣緩沖液，煮沸10.0 min，離心沉淀再次超聲后取10.0 μL加入10.0 μL上樣緩沖液煮沸10.0 min后點樣體積分?jǐn)?shù)為15%SDS-PAGE檢測，觀察目的蛋白的表達(dá)純化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET15-AtSEP3原核表達(dá)載體的構(gòu)建

測序驗證得到2個不同結(jié)構(gòu)域的AtSEP3結(jié)構(gòu)域的序列，構(gòu)建不同大小結(jié)構(gòu)域的載體（圖1）［11］。轉(zhuǎn)化成功的菌株提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定均得到目的片段，成功構(gòu)建得到不同結(jié)構(gòu)域的pET15b-AtSEP3原核表達(dá)載體。

圖1 pET15b-AtSEP3重組蛋白構(gòu)建圖Figure 1 AtSEP3 protein domain construction

2.2 重組AtSEP3蛋白的可溶性條件優(yōu)化

將構(gòu)建好的原核表達(dá)菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，用裂解液溶解蛋白，SDS電泳圖中（圖2）箭頭所指是目的蛋白，檢測發(fā)現(xiàn)AtSEP3A（30 kDa）以包涵體形式表達(dá)，AtSEP3B（18 kDa）為可溶蛋白。實驗表明，包含部分IKC區(qū)的AtSEP3B以pET-15b為原核表達(dá)載體，在22℃條件下終濃度0.1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)15.0 h，得到高表達(dá)的可溶蛋白。

圖2 AtSEP3融合蛋白的可溶性表達(dá)篩選Figure 2 Screening for soluble AtSEP3 protein expression

2.3 肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定重組蛋白

為了檢測原核表達(dá)蛋白，對SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色后顯示的目的蛋白進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定。北京信科奧康科技有限公司提供的初始檢索結(jié)果顯示（檢索程序是Mascot：http://www.matrixscience.com，數(shù)據(jù)庫為SwissProt）：目的蛋白與蛋白NP_850953.1，鑒定得分為92分，檢測結(jié)果中有18條肽段與目的蛋白序列相匹配（圖3A），紅色部分表示與目的蛋白所匹配的多肽片段，匹配部分占目的蛋白的42%。Mascot Score直方圖（圖3B），蛋白得分大于53分具有顯著性差異（P＜0.05），陰影區(qū)域為不可信任結(jié)果，陰影外紅色表示匹配的結(jié)果，與數(shù)據(jù)庫比對得到驗證。Mascot Score直方圖所示如下，左側(cè)的小片段相匹配的肽段不具備顯著性差異，沒有說明意義，右側(cè)紅色柱狀圖表示與數(shù)據(jù)庫蛋白相匹配的肽段，且具有顯著性差異，說明純化的融合蛋白是AtSEP3蛋白。

2.4 AtSEP3B可溶蛋白的純化

純化各階段產(chǎn)物的電泳結(jié)果如下圖4A所示。作為標(biāo)準(zhǔn)的小牛血清蛋白（BSA）溶液以單體和二聚體形式存在，大小分別是67 kDa和134 kDa。黑色實線表示AtSEP3B，峰值位置接近BSA單體67 kDa。圖4B中SDS-PAGE檢測蛋白凝膠過濾層析后樣品純度，箭頭所指為目的蛋白，說明純化得到了高純度的AtSEP3B蛋白，其單肽鏈為18 kDa，圖4A中峰值大小靠近67 kDa左右，表明純化的AtSEP3B是以四聚體形式存在。

3 討論

雖然植物開花分子機(jī)制的研究在模式植物上已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是隨著研究的深入凸現(xiàn)了一些新的問題，例如植物控制花器官形成過程中的分子機(jī)制，MADS盒蛋白的結(jié)構(gòu)及其功能機(jī)制均不明確。本研究以擬南芥成花過程中重要的調(diào)控基因SEP3為例，設(shè)計了不同結(jié)構(gòu)域的載體片段，純化得到了可溶的AtSEP3蛋白。

圖3 AtSEP3蛋白質(zhì)肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定（A）及Mascot Score直方圖（B）Figure 3 Identification of AtSEP3 protein by mass spectrometry（A）and Mascot Score histogram of mass fingerprinting（B）

SEP3基因以高級復(fù)合物的形成存在，在開花不同環(huán)節(jié)中都扮演著重要作用［12］，在ABCE模型形成的各個階段都不可缺少。SEP3蛋白結(jié)合特異性的DNA片段后行使其轉(zhuǎn)錄因子的作用，還與其他特定的蛋白相互作用從而激活或抑制下游基因蛋白的功能［13］。Immink等［9］在2009年提出的SEP3四元體模型，其中MADS盒的M結(jié)構(gòu)域結(jié)合DNA并穩(wěn)定四聚體。本研究通過對AtSEP3蛋白結(jié)構(gòu)域的分析表明，SEP3蛋白在形成四聚體時并不需要M結(jié)構(gòu)域。換言之，結(jié)合DNA對四聚體的形成是不必要的。

圖4 重組蛋白AtSEP3B的凝膠過濾層析柱圖（A）及SDS檢測（B）Figure 4 Gel filtration of AtSEP3B proteins

大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)適合多種原核基因和真核基因的蛋白表達(dá)。但外源蛋白的表達(dá)以及是否可溶與多種因素有關(guān)，包括表達(dá)溫度、原核表達(dá)載體、結(jié)構(gòu)域構(gòu)建以及表達(dá)菌株。溫度對于SEP3表達(dá)的可溶性有重要的影響。降低誘導(dǎo)溫度，延長表達(dá)時間明顯有利于SEP3外源蛋白的正確折疊和表達(dá)產(chǎn)量?？扇苄耘c目的蛋白的性質(zhì)也密切相關(guān)，極性的均一性影響著蛋白的可溶表達(dá)。生物信息學(xué)預(yù)測表明SEP3蛋白M區(qū)是親水性，其他IKC區(qū)是疏水性。本研究篩選了不同的片段和原核表達(dá)體系，最終獲得了AtSEP3B結(jié)構(gòu)域片段的可溶性表達(dá)。這些結(jié)構(gòu)域以四聚體形式存在，疏水區(qū)域有可能構(gòu)成單體相互作用界面，穩(wěn)定了四聚體，其余部分構(gòu)成四聚體親水表面，促進(jìn)了蛋白可溶性。進(jìn)一步通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法分析SEP3蛋白四聚體形成以及空間結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系正在進(jìn)行中。

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Arabidopsis thaliana SEPALLATA3 protein in a prokaryotic system

ZHOU Jiaping，LIN Xinchun，XU Yingwu
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A & F University，Lin’an 311300，Zhejiang，China）

The transcription factor ofSEPALLATA3（SEP3）belongs to the E class gene of the ABCE model of flower development.SEP3 has been shown to mediate complex formation and，therefore，a special attention was paid to its structure-function relationship.To determine how SEPALLATA3 protein oligomers were formed，the oligomeric status was studied by obtaining soluble protein expression in vitro.TheSEPgene（At-SEP3）was constructed as a fusion protein and expressed in prokaryotic cells.After determining an optimal expression strategy，nickel chelating resin was used to purify the protein which was displayed as a tetramer in size exclusion chromatography（SEC）.To get the high efficiency of soluble protein，different structural domains and expression conditions were screened，and 0.1%IPTG inducing at 22℃for 15 h produced an optimal expression strategy.These preliminarily results provided an important basis for further study of the structurefunction relationship.Overall，these results indicat that the SEP3‘glue’protein in mediating multimerization is based on homomeric interactions.［Ch，4 fig.13 ref.］

botany；SEP3 protein；prokaryotic system；protein purification；polymer

S601；S718.3

A

2095-0756（2014）01-0014-05

10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.003

2012-12-21；

2013-04-01

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（“973”計劃）項目（2011CB111500）；國家自然科學(xué)基金資助項目（31270715，31000295）；浙江農(nóng)林大學(xué)科學(xué)研究發(fā)展基金資助項目（2010FR072）

周佳平，從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：zhoujiaping100@163.com。通信作者：徐英武，教授，博士，從事生物物理學(xué)等研究。E-mail：yxu@zafu.edu.cn