鄒翠翠，俞飛，沈衛(wèi)東，張珊珊，王俊龍，張汝民，侯平

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300；2.天目山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū) 管理局，浙江 臨安 311311）

酸雨與凋落物復(fù)合作用對(duì)柳杉種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)的影響

鄒翠翠1，俞飛1，沈衛(wèi)東2，張珊珊1，王俊龍1，張汝民1，侯平1

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300；2.天目山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū) 管理局，浙江 臨安 311311）

采用培養(yǎng)皿法研究了不同pH值模擬酸雨、柳杉Cryptomeria fortunei凋落物水浸提液和酸雨浸提液對(duì)柳杉種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，并采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)柳杉凋落物水浸提液和酸雨浸提液的化學(xué)成分進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：①酸雨和凋落物水浸提液處理均降低柳杉種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，凋落物酸雨浸提液處理柳杉種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明酸雨增強(qiáng)了凋落物對(duì)柳杉種子萌發(fā)的抑制作用。②酸雨處理抑制柳杉幼苗根生長(zhǎng)和根芽比，而pH 3.0處理芽生長(zhǎng)和生物量則顯著減?。≒＜0.05）；50 g·L-1凋落物水浸提液處理對(duì)柳杉幼苗芽和根的生長(zhǎng)，以及生物量和根芽比具有顯著的抑制作用（P＜0.05），凋落物酸雨浸提液處理抑制作用呈極顯著差異（P＜0.01）。③GC-MS分析顯示，柳杉凋落物水浸提液和酸雨浸提液的主要成分是醇類、酚類、烷烯類和酯類等化合物，占總量的86.1%，凋落物酸雨浸提液中鑒定出新的化合物包括4種酮類化合物和2個(gè)醇類，占總量的2.6%。圖4表1參30

森林生態(tài)學(xué)；柳杉；凋落物；酸雨；化感物質(zhì)；種子萌發(fā)；幼苗生長(zhǎng)

酸雨對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的危害已成為舉世矚目的重大環(huán)境問(wèn)題［1］，而中國(guó)成為繼歐洲和北美之后的第三大酸雨區(qū)［2］。研究發(fā)現(xiàn)，酸雨是造成森林衰退的直接原因。酸雨能夠抑制植物種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)［3-5］。Park等［6］研究發(fā)現(xiàn)模擬酸雨對(duì)鼠耳芥Arabidopsis thaliana種子萌發(fā)與根芽生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用；水稻Oryza sativa，小麥Triticum aestivum和油菜Brassica chinensisvar.oleifera等3種植物對(duì)酸雨脅迫強(qiáng)度與脅迫時(shí)間的耐受性存在顯著差異［7-8］。Ahmed等［9］研究發(fā)現(xiàn)，赤桉Eucalyptus camaldulensis凋落物對(duì)黃豆樹Albizia procera和銀合歡Leucaena glauca種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)均有抑制作用；羅俠等［10］研究認(rèn)為，天山云杉Picea schrenkiana凋落物提取液對(duì)自身種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)具有自毒作用，并且與提取液濃度呈正相關(guān)。有關(guān)酸雨和凋落物復(fù)合作用對(duì)種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)影響的報(bào)道甚少。柳杉Cryptomeria fortunei為常綠針葉喬木，屬國(guó)家一級(jí)保護(hù)樹種，浙江省臨安市天目山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)是世界上最大的柳杉種群聚集地，而臨安市在2006年和2007年的酸雨發(fā)生率分別高達(dá)85%和95%［11-12］。自20世紀(jì)90年代初期以來(lái)，天目山的柳杉種群逐漸呈現(xiàn)出衰退的跡象。針對(duì)天目山柳杉林的研究主要集中在柳杉的病蟲害防治［13-14］和蓄積量［15-16］等方面，尚缺乏酸雨與柳杉凋落物復(fù)合作用對(duì)柳杉天然更新影響方面的研究。因此，我們以柳杉為供試樹種，模擬酸雨、柳杉凋落物水浸提液和pH4.0酸雨浸提液對(duì)柳杉種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，并采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）技術(shù)分析鑒定了浸提液的化合物成分，為闡明天目山柳杉天然更新困難和退化原因提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試柳杉凋落物2011年10月采自天目山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)天然柳杉林，凋落物帶回實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干后粉碎，備用。柳杉種子由天目山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局提供，置于4℃冰箱中保存。

1.2 研究方法

1.2.1 酸雨溶液的制備 根據(jù)浙江省臨安市的酸雨監(jiān)測(cè)分析資料及前人配置模擬酸雨的方法，用濃硫酸和濃硝酸按摩爾比4∶1配置母液，并用蒸餾水分別稀釋成pH 3.0，pH4.0和pH 5.6模擬酸雨溶液。

1.2.2 柳杉凋落物浸提液的制備 準(zhǔn)確稱取柳杉凋落物干粉10 g 2份，置于三角瓶中，分別加入100 mL蒸餾水和pH4.0模擬酸雨溶液，在25℃條件下浸提48 h，離心后過(guò)濾2次，得到100 g·L-1的浸提液，置于4℃冰箱中備用。試驗(yàn)前將母液分別配置成5 g·L-1和50 g·L-1的處理液，以蒸餾水作對(duì)照。

1.2.3 柳杉凋落物浸提液化學(xué)成分分析 取5 mL柳杉凋落物酸雨和水浸提液母液加入2 mL乙酸乙酯萃取，吸取1 μL萃取液進(jìn)樣，進(jìn)行GC-MS分析。GC（7890A，Agilent Technologies Company）條件：色譜柱HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）；升溫程序初始溫度50℃，以20℃·min-1的速率升至180℃，保持2 min，再以10℃·min-1升到250℃，保持10 min；載氣為氦氣，進(jìn)樣口溫度280℃。MS（5975C，Agilent Technologies Company）條件，電離方式EI；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；四級(jí)桿溫度150℃；傳輸線溫度250℃；掃描質(zhì)量范圍28～450。通過(guò)NIST 2008譜圖庫(kù)兼顧色譜保留時(shí)間定性，采用峰面積表示物質(zhì)含量。

1.2.4 柳杉種子萌發(fā)與幼苗培養(yǎng) 選取籽粒飽滿、均勻一致的柳杉種子，用40℃的溫水浸種24 h，再用質(zhì)量濃度為10 g·L-1的高錳酸鉀溶液消毒15 min后，用蒸餾水反復(fù)沖洗5～6次。取100粒均勻置于墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿（直徑15 cm，105℃條件下消毒2 h）中，并加入5 mL相應(yīng)浸提液，對(duì)照加蒸餾水5 mL，設(shè)3次重復(fù)，置于事先用乙醇進(jìn)行消毒處理的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：光照14 h（25℃）/黑暗10 h（20℃）；光強(qiáng)80 μmol·m-2·s-1；空氣相對(duì)濕度為60%。處理組補(bǔ)充1 mL·d-1相應(yīng)濃度浸提液，對(duì)照組補(bǔ)充1 mL·d-1蒸餾水。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 種子萌發(fā)的測(cè)定 按照ISTA 1996《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》（胚根突出種皮的長(zhǎng)度為種子長(zhǎng)度的一半即為發(fā)芽的種子），每天統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)。第15天統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽勢(shì)，第24天統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率。

1.3.2 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 發(fā)芽實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用刻度尺測(cè)量萌發(fā)后幼芽與幼根長(zhǎng)度，隨機(jī)測(cè)量10株·處理-1，取其平均值即為幼芽與幼根生長(zhǎng)。隨機(jī)選擇10株幼苗，稱鮮質(zhì)量，設(shè)3次重復(fù)·處理-1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件最小顯著差法（LSD）多重比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)用以下公式計(jì)算：發(fā)芽率（PG）=終發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；發(fā)芽勢(shì)（EG）=第15天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%。參照Williamson等［17］的化感效應(yīng)指數(shù)（IR）進(jìn)行化感效應(yīng)分析。當(dāng)T≥C時(shí)，IR=1-C/T；當(dāng)T≤C時(shí)，IR=T/C-1，其中C為對(duì)照值，T為處理值。IR＞0為促進(jìn)作用，IR＜0為抑制作用，絕對(duì)值大小和作用強(qiáng)度一致。

2 結(jié)果分析

2.1 柳杉凋落物浸提液的成分及含量分析

通過(guò)GC-MS分析，在凋落物水浸提液和凋落物酸雨浸提液（pH4.0）中均發(fā)現(xiàn)了醇類、酚類、烷烯類、酯類、酮類和醛類等化合物（圖1，表1）。水浸提液中鑒定出42種化合物，其中醇類化合物19種，占總量的36.2%；酚類化合物5種，占總量的19.8%；烷烯類化合物共7種，占總量的15.7%；酯類化合物共3種，占總量的13.4%；酮類化合物5種，占總量的6.3%；醛類化合物3種，占總量的2.4%。酸雨浸提液中鑒定出48種化合物，其中新提取化合物包括4種酮類化合物和2個(gè)醇類，占了總量的2.6%。凋落物酸雨浸提液的總離子流比凋落物水浸提液的強(qiáng)。

圖1 柳杉凋落物浸提液的總離子流圖Figure 1 Total ion current of extract ingredients from litters of Cryptomeria fortunei

2.2 不同處理對(duì)柳杉種子萌發(fā)的影響

酸雨、凋落物水浸提液和凋落物酸雨浸提液對(duì)柳杉種子萌發(fā)的影響具有明顯差異（圖2）。pH 5.6和pH4.0酸雨對(duì)柳杉種子萌發(fā)無(wú)顯著影響，pH 3.0酸雨處理顯著降低柳杉種子發(fā)芽率（P＜0.05），與對(duì)照相比降低了6.9%；5 g·L-1凋落物水浸提液處理顯著降低柳杉種子發(fā)芽率（P＜0.05），比對(duì)照降低了15.6%，且隨著浸提液質(zhì)量濃度的增大對(duì)柳杉種子發(fā)芽率的抑制作用加強(qiáng)；5 g·L-1酸雨浸提液處理極顯著降低柳杉種子發(fā)芽率（P＜0.01），與對(duì)照相比降低了26.3%；pH 5.6酸雨處理對(duì)柳杉種子發(fā)芽勢(shì)無(wú)顯著影響，pH4.0酸雨處理顯著降低柳杉種子發(fā)芽勢(shì)（P＜0.05），與對(duì)照相比降低了16.8%。5 g·L-1凋落物水浸提液和凋落物酸雨浸提液處理均顯著降低柳杉種子發(fā)芽勢(shì)（P＜0.05），分別比對(duì)照降低了17.8%和25.2%，且隨著浸提液質(zhì)量濃度的增大對(duì)柳杉種子發(fā)芽勢(shì)的抑制作用加強(qiáng)。

2.3 不同處理對(duì)柳杉幼苗生長(zhǎng)的影響

pH 5.6和pH4.0酸雨處理對(duì)柳杉幼苗芽生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，pH 3.0顯著抑制柳杉幼苗芽生長(zhǎng)（P＜0.05），與對(duì)照相比降低了10.2%（圖3）；5 g·L-1凋落物水浸提液處理顯著抑制柳杉幼苗芽生長(zhǎng)（P＜0.05），與對(duì)照相比降低了13.7%；5 g·L-1酸雨浸提液處理極顯著抑制柳杉幼苗芽生長(zhǎng)（P＜0.01），與對(duì)照相比降低了17.1%。pH 5.6酸雨處理對(duì)柳杉幼苗根生長(zhǎng)影響不顯著，pH4.0和pH 3.0酸雨處理顯著抑制柳杉幼苗根生長(zhǎng)（P＜0.05），分別比對(duì)照降低了15.9%和18.8%。5 g·L-1凋落物水浸提液和凋落物酸雨浸提液處理均顯著抑制柳杉幼苗根生長(zhǎng)（P＜0.05），分別比對(duì)照降低了22.7%和31.9%，并且隨著浸提液質(zhì)量濃度的增大對(duì)柳杉芽和根生長(zhǎng)的抑制作用加強(qiáng)。

表1 柳杉凋落物水浸提液和酸雨浸提液成分分析Table 1 Chemical components of aquatic and acid extracts from litter of Cryptomeria fortunei

表1 （續(xù)）

圖2 不同處理對(duì)柳杉種子萌發(fā)的影響Figure 2 Effects of different treatments on the seed germination of Cryptomeria fortunei

圖3 不同處理對(duì)柳杉幼苗生長(zhǎng)的影響Figure 3 Effects of different treatments on seeding growth of Cryptomeria fortunei

2.4 不同處理對(duì)柳杉幼苗生物量的影響

圖4 不同處理對(duì)柳杉幼苗生物量的影響Figure 4 Effects of different treatments on biomass of Cryptomeria fortunei

酸雨、凋落物水浸提液和凋落物酸雨浸提液均顯著降低柳杉幼苗生物量（圖4）。pH 5.6酸雨處理顯著降低柳杉幼苗生物量（P＜0.05），與對(duì)照相比降低了9.0%，且隨著pH值的降低抑制強(qiáng)度增大；5 g·L-1凋落物水浸提液和凋落物酸雨浸提液處理均極顯著降低柳杉幼苗生物量（P＜0.01），分別比對(duì)照降低了27.4%和37.8%，且隨著浸提液質(zhì)量濃度的增大對(duì)柳杉幼苗生物量的抑制作用加強(qiáng)。酸雨處理對(duì)柳杉幼苗的根芽比無(wú)顯著影響。50 g·L-1凋落物水浸提液和凋落物酸雨浸提液處理均顯著抑制柳杉幼苗根芽比（P＜0.05），分別比對(duì)照減少了0.14和0.23，且隨著浸提液質(zhì)量濃度增大對(duì)柳杉根芽比的抑制作用加強(qiáng)。

3 討論與結(jié)論

發(fā)芽率是反映種子質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)，而發(fā)芽勢(shì)反映了種子的活力狀況。這2個(gè)指標(biāo)是反映環(huán)境脅迫對(duì)植物種子萌發(fā)影響程度的重要指標(biāo)，而生長(zhǎng)指標(biāo)可以更直觀地顯示植物幼苗受環(huán)境脅迫的程度。大量研究［18-21］表明：酸雨和化感作用對(duì)植物種子萌發(fā)過(guò)程、幼苗和根系的生長(zhǎng)發(fā)育有抑制作用。本研究結(jié)果表明：酸雨和凋落物水浸提液處理使柳杉種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)降低，這可能是由于酸雨制約種子儲(chǔ)藏物質(zhì)分解、運(yùn)輸及細(xì)胞增殖和新器官的構(gòu)建［22-24］，而柳杉凋落物中的酚酸等化感物質(zhì)抑制了種子萌發(fā)時(shí)所需的關(guān)鍵酶類［25-26］。酸雨和凋落物水浸提液處理使柳杉幼苗根生長(zhǎng)和芽生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制作用，降低了柳杉幼苗生物量和根芽比。這可能是由于酸和化感物質(zhì)抑制種子保護(hù)酶的活性，破壞了細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞代謝異常，影響了胚的正常發(fā)育，加劇植物細(xì)胞的質(zhì)膜過(guò)氧化［27-28］。酸雨和凋落物復(fù)合作用對(duì)柳杉種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)以及芽生長(zhǎng)、根生長(zhǎng)、根芽比和幼苗生物量的抑制效果比酸雨和凋落物水浸提液增強(qiáng)，其原因可能是酸雨增強(qiáng)了凋落物次生代謝物質(zhì)的釋放［29］，從而使凋落物化感物質(zhì)的種類和數(shù)量增多。

本研究表明：柳杉凋落物水浸提液和酸雨浸提液的主要化學(xué)物質(zhì)為醇類、酚類、烷烯類、酯類、酮類和醛類等化合物，凋落物酸雨浸提液中鑒定出的新提取化感物質(zhì)包括4種酮類化合物和2個(gè)醇類，占了總量的2.6%，與其他植物的化感物質(zhì)相類似［30］，高質(zhì)量濃度時(shí)不僅降低受試植物種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，同時(shí)還減少幼苗根生長(zhǎng)和芽生長(zhǎng)，降低植物幼苗的生物量。大多數(shù)化感物質(zhì)具有廣譜性作用機(jī)制，能夠影響生物的許多生理生化過(guò)程，柳杉凋落物水浸提液中以二乙酸-2-甲基間苯二酚含量最高，酸雨浸提液中以鄰苯二甲酸二丁酯含量最高，很可能是影響柳杉凋落物自毒作用的主要化感物質(zhì)。

綜上所述，本研究證實(shí)：酸雨增強(qiáng)了柳杉凋落物浸提液的化感強(qiáng)度，加強(qiáng)了柳杉凋落物的自毒作用，凋落物酸雨浸提液化感物質(zhì)種類和含量的增加也證明了這點(diǎn)。此外，本研究通過(guò)GC-MS分析，進(jìn)一步檢測(cè)出更多的柳杉凋落物化感物質(zhì)成分，對(duì)柳杉凋落物自毒作用產(chǎn)生的影響在整個(gè)柳杉天然更新中所占的比例究竟有多大有了更明確的估計(jì)，為酸雨干擾下柳杉凋落物對(duì)柳杉天然更新影響機(jī)制提供依據(jù)。

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Combined effects of acid rain and litter on seed germination and seedling growth of Cryptomeria fortunei

ZOU Cuicui1，YU Fei1，SHEN Weidong2，ZHANG Shanshan1，WANG Junlong1，ZHANG Rumin1，HOU Ping1
（1.The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A&F University，Lin’an 311300，Zhejiang，China；2.Management Office，National NatureReserve of Mount Tianmu，Lin’an 311311，Zhejiang，China）

In order to understand the combined effects of acid rain and litter on the growth ofCryptomeria fortunei，we studied the effects of the acid rain,aquatic extract and acid rain extracts from litter on the seed germination and seedling growth ofC.fortuneiby using petri dishes culture method，and analyzed the chemical components of the extracts using GC-MS.Results showed that：（1）Both simulated acid rain and aquatic extracts reduced the seed germination rate and germination potential ofC.fortunei.Under the effects of acid rain extracts the seed germination rate and germination potential were significantly different from the controlled ones（P＜0.05）.It is indicated that acid rain enhanced the inhibition effect of allelochemicals fromC.fortuneilitter on its seed germination.（2）Acid rain declined the ratios of root to bud and root growth ofC.fortunei.And acid rain（pH 3.0）significantly reduced the bud growth and biomass（P＜0.05）.At 50 g·L-1the aquatic extracts significantly declined the root and bud growth，biomass and the ratios of root to bud（P＜0.05）.The growth indicators are significantly different from effects of acid rain extracts with the controlled ones（P＜0.01）.（3）42 secondary metabolic compounds were identified in the aquatic litter extract ofC.fortunei.The major compounds of the aquatic litter extracts and acid rain litter extracts were alcohols，phenolics，betweenanenes and esters,which all together accounted for 86.1%of the total.And in acid rain extracts，of which the newly released compounds including 4 ketones and two alcohols,accounted for 2.6%of the total.［Ch，4 fig.1 tab.30 ref.］

forest ecology；Cryptomeria fortunei；litter；acid rain；allelochemicals；seed germination；seedling growth

S718.51

A

2095-0756（2014）01-0001-08

10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.001

2013-01-10；

2013-04-16

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y3100361，Y305235）；浙江農(nóng)林大學(xué)科研發(fā)展基金資助項(xiàng)目（2010FR058，2008FR101）

鄒翠翠，從事植物生理生態(tài)研究。E-mail：zoucuicui168@163.com。通信作者：侯平，教授，博士，從事旅游生態(tài)學(xué)和恢復(fù)生態(tài)學(xué)等研究。E-mail：houpingg@263.net