李影　張東浩

【摘要】 目的 探討尿液結(jié)核分枝桿菌檢測在腎結(jié)核診斷中的應(yīng)用價值。方法 對108例已確診為腎結(jié)核的患者尿液標(biāo)本分別采取抗酸菌涂片染色、改良羅氏培養(yǎng)、熒光定量PCR三種方法進行檢測， 其結(jié)果進行分析。結(jié)果 抗酸菌涂片染色、改良羅氏培養(yǎng)、熒光定量PCR檢測尿液中結(jié)核分枝桿菌的陽性率分別為25.9%、51.9%、72.2%。結(jié)論 尿液結(jié)核分枝桿菌檢測屬病原學(xué)檢測， 特異性好、操作簡便， 對腎結(jié)核的診斷有著重要的應(yīng)用價值。

【關(guān)鍵詞】 尿液；結(jié)核分枝桿菌；腎結(jié)核；診斷

結(jié)核病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一， 據(jù)WHO估計， 全球有約20億人感人結(jié)核分枝桿菌， 每年有約200萬人死于結(jié)核病[1]。近年來， 隨著結(jié)核病發(fā)病率在全球范圍內(nèi)的回升， 腎結(jié)核的發(fā)病率也明顯增加。據(jù)統(tǒng)計， 全球每年有近千萬人感染結(jié)核病， 而腎結(jié)核約占其中的8%～20%。該病進展隱蔽， 發(fā)現(xiàn)時， 腎功能已部分或完全喪失， 患者早期診斷困難， 以致延誤治療， 對人們的身體健康危害極大。因此早診斷對治療尤為重要。在眾多輔助檢查中， 除病理診斷外， 實驗室病原學(xué)檢查具有較高的特異性， 且操作簡便， 患者無痛苦?，F(xiàn)就最常用的抗酸菌涂片染色、改良羅氏培養(yǎng)、熒光定量PCR三種檢測方法進行分析， 評價其在尿液結(jié)核分枝桿菌檢測對腎結(jié)核診斷的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 2010年11月～2013年10月本院住院的腎結(jié)核患者， 共計108例。男性58例， 女性50例。其中小于20歲者7例， 大于40歲者27例， 20～40歲者74例， 占68.5%；單側(cè)腎結(jié)核87例， 雙側(cè)腎結(jié)核21例；合并其他臟器結(jié)核?。ㄈ绶谓Y(jié)核、脊柱結(jié)核、腸結(jié)核、附睪結(jié)核等）65例， 約占60.2%。

1. 2 標(biāo)本收集

1. 2. 1 抗酸菌涂片染色檢測 留取12 h尿液， 靜置， 傾去上清液， 留取沉淀部分30 ml， 以3000 rpm離心30 min， 棄上清， 取沉淀物涂片。

1. 2. 2 改良羅氏培養(yǎng)和熒光定量PCR檢測 囑患者留取晨尿， 因晨尿濃縮， 適用于做病原學(xué)檢查。在留取尿液之前先用消毒液清洗外陰， 以去除污染菌。分別留取中段尿約20～30 ml于一次性無菌塑料標(biāo)本杯中各一杯。為提高檢出率， 所有患者均連續(xù)留取3 d標(biāo)本， 置于2～8℃冰箱中貯存， 于3 d后將尿液混合進行改良羅氏培養(yǎng)和熒光定量PCR檢測。如患者正在進行抗結(jié)核藥物治療時， 應(yīng)停用所有抗結(jié)核藥一周， 以提高結(jié)核桿菌的檢出率。

1. 3 試劑與儀器

1. 3. 1 抗酸菌涂片染色 試劑由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。無需特殊儀器。

1. 3. 2 羅氏培養(yǎng) 改良酸性羅氏培養(yǎng)基由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。隔水式培養(yǎng)箱由天津市泰斯特儀器有限公司提供。

1. 3. 3 熒光定量PCR 由中山大學(xué)達安基因股份有限公司提供試劑。儀器LightCycler 3.5全自動熒光定量基因擴增儀由羅氏公司提供。

1. 4 方法

1. 4. 1 抗酸菌涂片染色 取制備好的尿沉淀物0.05～0.10 ml均勻涂于玻片上， 直徑約2～3 cm， 火焰固定。滴加石碳酸復(fù)紅染液布滿標(biāo)本， 保持3～5 min。流水自玻片一端沖洗洗去染液， 瀝干剩余水分。滴加3%的鹽酸酒精， 1～3 min后流水沖洗瀝干。滴加美藍染液， 0.5～1 min后流水沖洗瀝干。置于干燥箱中干燥后鏡檢。

1. 4. 2 改良羅氏培養(yǎng) 將標(biāo)本進行離心， 以2000 rpm/min離心3 min為宜， 取離心沉淀后的尿沉渣標(biāo)本0.1～0.3 ml， 以無菌操作接種于培養(yǎng)基斜面上， 一般每份標(biāo)本同時接種2支培養(yǎng)管。將接種好的培養(yǎng)管置于35～37℃培養(yǎng)箱中孵育， 5%～10%的CO2可以促進分枝桿菌的生長， 培養(yǎng)管須松蓋傾斜放置24 h后再將蓋子鎖緊， 垂直放置。接種并孵育第一周需每天判讀一次菌落生長情況。此后每周判讀一次， 記錄菌落生長及污染情況。判讀如發(fā)現(xiàn)斜面培養(yǎng)基上有菌落出現(xiàn)， 須挑取菌落做成涂片進行抗酸染色鏡檢。

1. 4. 3 熒光定量PCR 取底部尿液標(biāo)本10～15 ml離心管中15000 rpm離心5 min。去上清， 沉淀加無菌生理鹽水1 ml打勻， 15000 rpm離心5 min， 去上清。加50 μl DNA提取液充分混勻， 100℃浴溫10 min， 待自然冷卻后， 10000 rpm離心5 min， 取上清液2 μl加入專用毛細(xì)管中4000 rpm離心3 min， 插入圓形卡盤倒置20 s后放入儀器中進行循環(huán)擴增。步驟為：93℃→2 min預(yù)變性， 然后按照93℃5 s→57℃45 s， 做40個循環(huán)， 最后置37℃延伸1 s。整個過程嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作， 擴增及結(jié)果判讀， 由電腦自動完成。

2 結(jié)果

三種方法檢測尿液結(jié)核分枝桿菌的陽性檢出率分別為抗酸菌涂片染色法25.9%（28/108）， 改良羅氏培養(yǎng)法51.9%（56/108）， 熒光定量PCR法72.2%（78/108）。

3 討論

近年來臨床不典型腎結(jié)核發(fā)病率有增加的趨勢[2]， 此外， 超過1/2的腎結(jié)核患者伴有全身其他部位的結(jié)核菌感染， 所以發(fā)現(xiàn)全身其他部位的結(jié)核病灶時， 應(yīng)進行全面檢查是否存在腎結(jié)核等結(jié)核性疾病， 而全身其他部位的結(jié)核病灶也支持腎結(jié)核的診斷。

在腎結(jié)核的診斷方法中， 主要為影像學(xué)檢查和病原學(xué)檢查。影像學(xué)檢查中， B超檢查對早期腎結(jié)核的診斷意義不大， 只適合腎結(jié)核初篩和治療后的復(fù)查[3]。IVU或CT的典型表現(xiàn)對中晚期腎結(jié)核具有確診價值[4]。因此， 病原學(xué)檢查對腎結(jié)核的早期診斷尤為重要。

抗酸菌涂片染色檢查是實驗室最基本的細(xì)菌學(xué)檢查方法。其優(yōu)點是操作簡便、快速， 無需任何設(shè)備， 廉價， 1～2 h即可回報結(jié)果， 對結(jié)核病早期診斷和病程的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸起著重要作用；缺點是受人為因素影響大， 靈敏度低， 檢出率一般只有25%～28%。通常需5000～10000條菌/ml才能得到陽性結(jié)果。endprint

改良羅氏培養(yǎng)法的優(yōu)點是靈敏度較高， 不易被污染， 特異性好， 操作簡便， 無需特殊儀器設(shè)備， 并可結(jié)核抗酸菌涂片檢測來鑒定死菌與活菌， 還可以進一步藥物敏感性的鑒定， 為臨床用藥提供可靠依據(jù)， 被譽為結(jié)核病診斷的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”；缺點是費用高， 操作流程長， 通常需6～8周才能獲得結(jié)果。

熒光定量PCR是一種密閉的擴增檢測系統(tǒng)， 所檢測的是結(jié)核分枝桿菌的特異DNA片段， 具有敏感度、特異度高及方便快速、自動化程度高等優(yōu)點， 特別是對難以培養(yǎng)與生長緩慢的結(jié)核桿菌的檢測更有優(yōu)勢[5]。只需極少量的病原標(biāo)本， 即可及時準(zhǔn)確的判定結(jié)果。陽性下限僅為10個拷貝/ml， 操作簡單， 只需2～3 h即可完成。缺點是實驗室環(huán)境要求極高（需按照相關(guān)法律法規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)實驗室并提交主管部門審批合格）， 因其檢出率高， 故而極微量的污染就可能造成假陽性結(jié)果。因此需聯(lián)合多項實驗室檢查可以提高腎結(jié)核診斷的特異性和敏感性。

綜上所述， 尿液結(jié)核分枝桿菌的檢測是診斷腎結(jié)核的關(guān)鍵， 且尿標(biāo)本簡單易取， 取樣不會給患者帶來痛苦和增加感染機會， 特異性好， 靈敏度較高， 對腎結(jié)核的早期診斷有明顯的優(yōu)勢。因此， 不難看出尿液結(jié)核分枝桿菌檢查對臨床腎結(jié)核以致泌尿系結(jié)核的診斷具有無可替代的重要作用。

雖然尿液結(jié)核分枝桿菌檢測對腎結(jié)核的診斷發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用， 但其檢測方法的的靈敏度和特異性還有待進一步提高， 且易出現(xiàn)假陰性和假陽性。因此， 完整的腎結(jié)核診斷仍然需要將病史、臨床表現(xiàn)、實驗室檢測、影像學(xué)分析、病理學(xué)診斷等方法相結(jié)合進行綜合分析， 才能提高腎結(jié)核早期診斷率， 為進一步的正規(guī)抗結(jié)核治療贏得時機。

參考文獻

[1] 張瑛，孫亞蒙，徐欣暉，等.結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗再結(jié)核性疾病中的診斷價值.中華臨床醫(yī)師雜志（電子版）， 2010， 12（4）：2431-2434.

[2] 石鶯，黃建軍.45例腎結(jié)核臨床病理分析.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生， 2005， 2（21）：133-135.

[3] 李邦國，戴輝，蔡爭，等.腎盂造影、CT對腎結(jié)核的診斷價值.醫(yī)學(xué)理論與實踐， 2005，18（1）：132-133.

[4] 裴林惠，丁建國.腎結(jié)核的CT診斷.中國基層醫(yī)藥， 2006， 11（1）：32-33.

[5] 彭麗，羅永艾.結(jié)核病的實驗室快速診斷.新醫(yī)學(xué)， 2005， 36（1）： 359-361.endprint