李志榮 ，楊光義 ，葉 方 ，杜士明 ，王 剛 ，杜 婷 ，孫榮進(jìn)

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院十堰市太和醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 十堰 442000； 2.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰 442000）

連翹是木犀科植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的干燥成熟果實，是常用的傳統(tǒng)中藥之一，具有清熱解毒、消腫散結(jié)等功效［1］，臨床主要用于治療急性風(fēng)熱感冒、癰腫瘡毒、淋巴結(jié)結(jié)核、尿路感染等癥。由于連翹生長周期較長，易受不良自然環(huán)境的影響而大量減產(chǎn)，造成市場缺口較大，而大量連翹葉卻被遺棄。現(xiàn)代研究表明，連翹葉有廣泛的藥用價值，如有抗菌、保肝、非特異性免疫、抗氧化等作用［2－6］，但一直以來缺乏對連翹葉的系統(tǒng)研究。本試驗通過對連翹葉和連翹果實進(jìn)行薄層色譜、紫外光譜鑒別，對灰分、浸出物及主要化學(xué)成分等進(jìn)行對比研究，探討連翹葉代替連翹果實藥用的可行性，為進(jìn)一步對連翹葉藥用、保健飲品等領(lǐng)域的潛在價值開發(fā)奠定理論和實驗基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

戴安UltiMateTM3000型高效液相色譜儀（美國戴安公司），包括四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測器和Chromeleon軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；TU－1901型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；AUW 120D型電子天平（日本島津公司）；CQX25－06型超聲波震蕩器（上海必能信超聲有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）；SX－4－10型高溫箱形電爐（上海三星電熱儀器廠）。連翹葉和連翹采自湖北十堰房縣連翹種植基地，由湖北醫(yī)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室陳吉炎教授鑒定為連翹葉Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl Folium和連翹；連翹苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為110821－200711）；乙腈、甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別［1］

精密稱取連翹苷對照品0.25 mg，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，備用，即得對照品溶液。分別取連翹葉和連翹粉末1 g置具塞錐形瓶中，加石油醚20mL，密塞，超聲處理15min，濾過，棄去石油醚液，殘渣揮干石油醚后加甲醇20mL，密塞，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5mL溶解，作為供試品溶液。分別取上述3種溶液適量點于同一薄層板上，以氯仿－甲醇（8∶2）為展開劑，以10%硫酸乙醇為顯色劑，105℃加熱至斑點顯色清晰，結(jié)果見圖1。可見，連翹葉和連翹中主要成分相近，在連翹苷所在的位置均有較明顯的斑點。

圖1 薄層色譜圖

2.2 紫外光譜鑒別

分別取2.1項下供試品溶液各1mL，用甲醇稀釋2000倍后，以甲醇為空白溶液，在200～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，紫外吸收光譜圖見圖2?？梢姡?00～500 nm波長范圍內(nèi)連翹和連翹葉的紫外吸收曲線相近，但連翹葉的吸光度大于連翹。

圖2 紫外吸收光譜圖

2.3 醇浸出物含量測定

參照2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅩA醇溶性浸出物冷浸浸出物測定法。取供試品約4 g，精密稱定，置250mL具塞錐形瓶中，精密加入一定濃度的乙醇溶液100mL，密塞，冷浸，前6 h內(nèi)時時振搖，再靜置18 h后用干燥濾器迅速濾過。精密量取濾液20mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30min，迅速精密稱定質(zhì)量。以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物的含量（%）。結(jié)果見表1?？梢?，連翹葉和連翹50%乙醇所得浸出物含量最高，而且連翹葉中浸出物含量高于連翹。

表1 連翹葉和連翹藥材浸出物含量測定結(jié)果（n＝3）

2.4 灰分含量測定

分別取連翹葉與連翹適量，粉碎過2號篩，稱取3～5 g，置熾灼至恒重的坩堝中，緩慢熾熱，至完全炭化時，逐漸升高溫度至500～600℃，使完全灰化至恒重，根據(jù)殘渣質(zhì)量，計算供試品中總灰分的含量（%）。待坩堝放冷，加入10%濃硫酸2mL，放在電爐上灼燒至無煙，殘渣照前法熾灼，至坩堝內(nèi)容物完全灰化，計算酸不容灰分的含量（%）。結(jié)果見表2?？梢姡B翹葉和連翹灰分含量相近，差異無顯著性。

2.5 連翹苷含量測定［1］

2.5.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（200mm ×4.6mm，5 μm）；流動相：乙腈 － 水（25 ∶75）；流速：1.0mL ／min；檢測波長：277 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

表2 連翹葉和連翹果實藥材灰分測定結(jié)果（n＝10）

2.5.2 溶液制備

取2.1項下對照品溶液，以0.45μm微孔濾膜濾過，備用。取連翹葉粉末（過5號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15mL，稱定質(zhì)量，浸漬過夜，超聲處理25min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液5mL，蒸至近干，加中性氧化鋁0.5 g拌勻，加在中性氧化鋁柱上，用70%乙醇120mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘渣用50%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻；從中精密量取1mL，稀釋至10mL，以0.45μm微孔濾膜濾過后作為連翹葉供試品溶液。按連翹葉供試品的制備方法，至過中性氧化鋁柱、洗脫液濃縮并定容至5 mL容量瓶中后，改為從中精密量取2mL，其他同連翹供試品溶液制備方法。

2.5.3 線性關(guān)系考察

取連翹苷對照品溶液，按擬訂色譜條件，分別進(jìn)樣10，14，18，22，26，30 μL，以被測物峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝7.8297C＋5.3008（r＝0.9990）。結(jié)果表明，連翹苷進(jìn)樣量在0.26～7.80μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5.4 含量測定

分別取連翹苷對照品溶液、供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見圖3。結(jié)果連翹與連翹葉中連翹苷含量分別為0.0862%和3.1496%。可見，連翹葉中連翹苷的含量明顯高于連翹。

3 討論

在對連翹葉和連翹薄層色譜分析中發(fā)現(xiàn)，連翹葉含有部分連翹所不含有的斑點，這些斑點有的可能是未除完的葉綠素或雜質(zhì)，有些是葉中獨有的物質(zhì)，但這些物質(zhì)有無藥用價值、有何藥用價值尚待進(jìn)一步研究。由圖2可見，連翹葉的吸收曲線高于連翹果實，說明連翹葉中所含某些化學(xué)成分可能高于連翹。藥材中灰分、浸出物含量的測定，可從一定程度上反映中藥的內(nèi)在質(zhì)量，也是中藥質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。查閱近年來對連翹葉與果實的研究狀況，其化學(xué)成分研究主要是醇溶部分，醇濃度太低，提取的淀粉、糖類物質(zhì)等溶出過多，不易過濾；醇濃度太高，水溶性有效成分溶出較低。因此本試驗參照2010年版《中國藥典（一部）》，考察了50%，75%，95%等不同濃度的乙醇對浸出物含量的影響，結(jié)果以50%的乙醇水溶液浸出效果最好，可能是該濃度下以連翹苷為代表的脂溶性成分和以連翹酯苷為代表的水溶性的成分均有較好的提取效果。對連翹葉和連翹中連翹苷的含量測定發(fā)現(xiàn)，連翹葉中連翹苷的含量明顯高于連翹葉，差異較大，與紫外吸收光譜結(jié)果一致，說明以連翹葉代替連翹藥用具有可行性，但需要調(diào)整用藥劑量。

圖3 高效液相色譜圖

參考文獻(xiàn)：

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：159.

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［3］楊建雄，劉 靜.連翹葉茶保肝作用的研究［J］.陜西師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2005，33（3）：82 －85.

［4］耿慧君，王文科，畢潤成.連翹葉的體外抗氧化活性研究［J］.陜西師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2005，19（4）：71 － 73.

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［6］牛新華，邱世翠，邸大琳，等.連翹體外抑菌作用的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2002，13（6）：342 －343.