張 寶 ，李世龍 ，葛保民 ，秦 莉 ，田珊紅 ，周秀艷 ，李 霞

（1.河北省唐山市傳染病醫(yī)院，河北 唐山 063000； 2.河北省唐山市人民醫(yī)院，河北 唐山 063000；3.河北省唐山市工人醫(yī)院，河北 唐山 063000）

目前，大多數(shù)乙型肝炎病毒（HBV）基因型研究的重點(diǎn)是A－F基因型。HBV的P區(qū)可編碼DNA復(fù)制所需的末端蛋白，而且參與了病毒復(fù)制的全過(guò)程，始于約2500 bp，C區(qū)與開(kāi)始區(qū)段重疊，中間區(qū)段與S區(qū)重疊，最后片段與X區(qū)重疊。研究認(rèn)為，HBV對(duì)核苷類(lèi)似藥物耐藥性的產(chǎn)生與HBV P基因多位點(diǎn)的變異有關(guān)。本研究中采用毛細(xì)管電泳直接測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了HBV基因型A－F及HBV P 區(qū)的 rtV173L，rtL180M，rtA181V ／T ／S，rtT184A ／G ／I／S，rtS202G ／I，rtM204V ／I，rtV207I／L ／G，rtS213T，rtV214A，rtQ215S，rtN236T，rtP237H，rtN238T ／D，rtM250V ／I位點(diǎn)突變情況并進(jìn)行分析?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源、試劑及儀器

樣本為2010年至2012年河北省唐山市傳染病醫(yī)院門(mén)診和住院部239例需要抗病毒治療的慢性乙型病毒性肝炎患者。其中男195例，年齡18～77歲，平均44.48歲；女44例，年齡20～63歲，平均 41.29歲；HBV－DNA均呈陽(yáng)性，且 HBV－DNA≥104拷貝／mL；診斷符合《乙型肝炎防治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。HBV及耐藥突變檢測(cè)試劑盒（核酸擴(kuò)增熒光定量及測(cè)序法），購(gòu)自上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司。ABI 310型系列PCR熒光檢測(cè)儀；Sequencing Analysis5.2軟件。

1.2 方法

采用核酸擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合熒光標(biāo)記探針雜交方法，對(duì)HBV－DNA進(jìn)行定量檢測(cè)。對(duì)定量檢測(cè)HBV－DNA≥5×103拷貝／mL的樣本，取其PCR產(chǎn)物3μL，再加入2μL蝦堿性磷酸酶（SAP）的混合物，混勻，37℃ 60 min，80℃ 15 min，最后于 4℃保存。取陽(yáng)性PCR酶解產(chǎn)物3μL、測(cè)序試劑（bigdye）1μL和測(cè)序產(chǎn)物2μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DNA測(cè)序產(chǎn)物經(jīng)一系列步驟純化后上機(jī)電泳，在自動(dòng)化的ABI310型基因分析儀上進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

收集整理原始數(shù)據(jù)錄入計(jì)算機(jī)，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

在使用抗病毒藥物的239例患者中，利用毛細(xì)管電泳法檢測(cè)到B基因型HBV感染者30例（12.55%），C基因型HBV感染者203例（84.94%）；D基因型 HBV感染者 1例（0.42% ），5例（20.%）HBV感染者低于最低檢測(cè)限?？梢?jiàn)，本組患者HBV基因型主要是C型和B型，這一結(jié)果與謝秀琴等［1］的研究結(jié)果相似。D基因型是在我國(guó)北方地區(qū)較少發(fā)現(xiàn)的基因型。但本研究中未檢出B和C混合型的基因型，這可能與病例數(shù)少或存在地區(qū)性差異有關(guān)，有待進(jìn)一步跟蹤。239例患者HBV耐藥性情況見(jiàn)表1。

3 討論

目前全球約1／3的人曾感染過(guò)HBV，其中有3.6億人發(fā)展為慢性乙型病毒性肝炎，我國(guó)約有慢性HBV感染者1.3億人，且每年死于HBV持續(xù)感染相關(guān)疾病［2］，包括肝細(xì)胞癌（HCC）的至少有100萬(wàn)人，最值得關(guān)注的是慢性HBV持續(xù)感染會(huì)發(fā)展為肝硬化、肝癌，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的抗HBV藥物主要有干擾素和核苷（酸）類(lèi)似物兩大類(lèi)，常用的核苷（酸）類(lèi)似藥物有拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定和恩替卡韋等，它們通過(guò)抑制HBV復(fù)制而在治療過(guò)程中促使乙型肝炎e抗原（HBeAg）的血清學(xué)轉(zhuǎn)換，并最終清除病毒，從而控制病情的進(jìn)展。對(duì)于慢性抗HBV感染者，HBV治療需要長(zhǎng)期用藥，通常情況下至少需要2年，若未經(jīng)專(zhuān)科醫(yī)生同意，在病情緩解不穩(wěn)固的情況下停藥，不僅不能抑制病毒，還可能加速病毒耐藥的發(fā)生，甚至使病毒的復(fù)制反彈，導(dǎo)致病情加重。臨床研究表明，拉米夫定治療1，2，3，4年的基因耐藥率分別為14%，38%，49%，66%；阿德福韋酯治療1，2，3，4，5年的基因耐藥率為0，3%，11%，18%，29%；在拉米夫定治療失敗的患者中，恩替卡韋治療1，2，3年的基因耐藥率為6%，14%，32%，其中伴有病毒反彈的臨床耐藥率分別為1%，10%，25%［3－4］。因此，在用藥過(guò)程中及時(shí)檢測(cè)病毒耐藥情況，有利于臨床及時(shí)調(diào)整用藥方案，控制病情進(jìn)一步發(fā)展。

表1 239例患者血清樣本HBV耐藥情況

HBV有較高的突變率和復(fù)制率，高度易突變性體現(xiàn)在，其DNA多聚酶在DNA復(fù)制過(guò)程的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)缺失校正活性，且HBV的各個(gè)基因區(qū)及多數(shù)調(diào)控元件都可能發(fā)生變異。另外，某些位點(diǎn)的變異可影響多個(gè)基因片段，原因就在于HBV基因存在基因重疊，變異病毒株可改變免疫原性和致病性，引起宿主免疫應(yīng)答的相應(yīng)變化，導(dǎo)致病情加重并趨復(fù)雜化，甚至惡性化成重癥肝炎；而且在長(zhǎng)期HBV感染過(guò)程中HBV發(fā)生變異，會(huì)引起病毒DNA與宿主DNA發(fā)生整合，誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生。

有文獻(xiàn)報(bào)道，拉米夫定變異的多為YMDD花式區(qū)域的rtM204V／I，而本研究檢測(cè)出拉米夫定主要的變異除rtM204V／I外，還有 rtL180M 變異及 rtV173L變異和 rtV207I／L／G，rtS213T變異，與 Aye 等［5］和 Hussain 等［6］的報(bào)道有一致性，大大提高了耐藥檢出率。這也提示rtV173L突變伴隨M180＋M204出現(xiàn)可能與拉米夫定耐藥相關(guān)，驗(yàn)證了William等［7］的報(bào)道。本研究中共檢出對(duì)拉米夫定耐藥的患者101例，占42.26%，其中8例拉米夫定耐藥血清中同時(shí)有3例對(duì)替比夫定耐藥，為單獨(dú)rtM204I／V／S變異所致；檢出對(duì)阿德福韋酯耐藥43例，占17.99%，耐藥率明顯低于拉米夫定，主要是 rtN236T，rtA181V ／I／S，rtN ／H238T ／D位點(diǎn)變異，并有1例rtV214A變異，1例rtN236T野生和突變共存株，1例rtQ215S野生和突變共存株，2例rtP237H野生和突變共存株；目前發(fā)現(xiàn)的恩替卡韋耐藥突變大多發(fā)生于拉米夫定耐藥的患者，主要由 rtM250V ／L，rtT184A ／G ／I／S，rtS202G ／I結(jié)合rtM204I／V／S＋rtL180M突變組成。另外，隨著抗病毒藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用，有35.56%的患者出現(xiàn)了拉米夫定、替比夫定和恩替卡韋共同耐藥，甚至已有3.35%的患者出現(xiàn)了拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定和恩替卡韋4種抗病毒藥共同耐藥的情況，這明顯加大了治療難度。

HBV各基因型之間存在著致病性和治療應(yīng)答方面的差異。可能與C基因型預(yù)后不良有關(guān)的是：B和C基因型之間的差異性體現(xiàn)在慢性乙型病毒性肝炎B＋C及C基因型患者經(jīng)拉米夫定治療后HBV－DNA陰轉(zhuǎn)率、HBeAg血清轉(zhuǎn)換率及ALT復(fù)常率均顯著高于B型慢性乙型病毒性肝炎患者［8］，并且C基因型與炎癥壞死及肝纖維化的關(guān)系更為密切，更易引起更嚴(yán)重的肝臟疾病如肝硬化和肝細(xì)胞癌；在年齡大于30歲的感染者中，尤為明顯的是Ba亞型患者的HBeAg陽(yáng)性率顯著高于Bj亞型，后者發(fā)生肝細(xì)胞癌的年齡顯著高于前者。對(duì)于拉米夫定耐藥變異的慢性乙型病毒性肝炎患者，YIDD變異主要發(fā)生于C基因型，B基因型多發(fā)生YVDD變異，且變異后的B基因型的HBV復(fù)制水平比C基因型要低，B基因型、C基因型拉米夫定耐藥的HBV病毒學(xué)分析對(duì)于患者的臨床用藥具有明確的指導(dǎo)價(jià)值。研究顯示，拉米夫定與阿德福韋酯聯(lián)合用藥對(duì)拉米夫定耐藥特別是基因B型HBV更有效［9］，但應(yīng)考慮長(zhǎng)期用藥會(huì)產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)［10］。本研究中利用毛細(xì)管電泳法檢測(cè)HBV，基因分型和耐藥位點(diǎn)，可指導(dǎo)臨床抗病毒藥物的正確選擇，可以提早2～3個(gè)月檢測(cè)到耐藥位點(diǎn)的變異情況。因此，適時(shí)進(jìn)行基因耐藥的檢測(cè)，可以預(yù)防“病毒學(xué)突破”的發(fā)生，先于臨床發(fā)現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，可及時(shí)指導(dǎo)臨床選擇抗病毒藥物，從而避免人力、物力、財(cái)力的極大浪費(fèi)，提高抗病毒藥物的療效，在一定程度延緩患者由慢性乙型病毒性肝炎發(fā)展為肝硬化、肝癌。

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