滕芳芳　胡曉斐　劉晨晨等

摘要[目的]探索LPS體外致人Chang Liver細(xì)胞損傷模型的建立方法和意義。[方法] 分別用20、40、60、80、100 μg/ml濃度的LPS作用Chang Liver細(xì)胞24 h，采用MTT法檢測LPS對Chang Liver細(xì)胞存活率的影響，分別測定Chang Liver細(xì)胞上清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γGT）、乳酸脫氫酶（LDH）的活性，并通過Hoechst 33258熒光染色觀察用藥24 h后Chang Liver 細(xì)胞形態(tài)的變化。[結(jié)果] 80和100 μg/ml濃度的LPS作用后Chang Liver細(xì)胞存活率顯著性降低， 胞外AST、ALT、ALP、γGT、LDH酶活性升高，細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，呈現(xiàn)細(xì)胞核固縮等細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。[結(jié)論] 用80 μg/ml的LPS與Chang Liver細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，可以建立理想的體外肝細(xì)胞損傷模型。

關(guān)鍵詞LPS； Chang Liver細(xì)胞； AST； ALT； Hoechst 33258

中圖分類號S986.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）04-01071-03

基金項目國家自然科學(xué)基金面上項目（81273429）；浙江省科技廳重大專項（2013C03036，2011C02003，2011C23034）；舟山市科技計劃項目（2012C23023）。

作者簡介滕芳芳（1989- ），女，浙江舟山人，碩士研究生，研究方向：海洋功能食品、海洋藥物。*通訊作者，教授，碩士生導(dǎo)師，從事海洋功能食品和海洋藥物研究。

脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的成分，其主要是由親水的多糖和疏水的類脂A組成。LPS可誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡造成多種細(xì)胞損傷，如巨噬細(xì)胞RAW264.7、人小肺癌細(xì)胞NCLH446、神經(jīng)細(xì)胞PC12、人子宮頸癌傳代細(xì)胞Hela cell等[14]。

不同的誘因?qū)е虏煌穆愿尾。胁《拘愿窝?、成藥物性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝病等均能造成肝?xì)胞損傷[5-6]，肝細(xì)胞損傷是肝病的共同病理基礎(chǔ)，是不同肝病的共同表現(xiàn)。因此，建立一個穩(wěn)定的肝細(xì)胞損傷模型，開展對肝細(xì)胞損傷機(jī)制的研究，有利于保肝機(jī)制的基礎(chǔ)研究。研究表明，LPS適合作為誘導(dǎo)肝損傷模型的藥物，特別是體內(nèi)LPS損傷建模已比較成熟，Debolina Nandi等用5 mg/只LPS劑量作用瑞士小鼠[7]。劉小偉等用4 mg/kg LPS劑量作用Balb/c小鼠[8]，成功建立了小鼠肝損傷模型。LPS雖多用于體內(nèi)建模的誘導(dǎo)劑，也可作為誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，但關(guān)于LPS對體外肝細(xì)胞損傷的誘導(dǎo)劑量尚未見報道。因此，筆者采用不同濃度LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，檢測上清液中肝損傷指標(biāo)酶活性變化，并觀察誘導(dǎo)后肝細(xì)胞的形態(tài)變化，從而初步建立一個LPS誘導(dǎo)的穩(wěn)定體外肝細(xì)胞損傷模型。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。正常人肝細(xì)胞：張氏肝細(xì)胞（Chang Liver）購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。

1.1.2主要試劑與設(shè)備。大腸桿菌脂多糖（0111：B4 LPS）、RPMI 1640、四氮唑藍(lán)（MTT），均購自Sigma公司；丙酮酸鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；AST、ALT、ALP、γGT、LDH試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所； Hoechest 33258染料購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)。人正常肝Chang Liver細(xì)胞，用含 10%胎牛血清，加入有雙抗溶液（青霉素 G100 IU/ml、鏈霉素 100 IU/ml）、0.11 g/L丙酮酸鈉的 RPMI 1640 培養(yǎng)基，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2MTT法。采用MTT法進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期的Chang Liver細(xì)胞制成懸液，接種至96孔板，每孔200 μl，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁5 h，再加入不同濃度的LPS（20、40、60、80、100 μg/ml），每個濃度設(shè)5個平行孔，同時設(shè)立不加樣品的對照組，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)結(jié)束加入180 μl PBS 和20 μl MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再用150 μl的DMSO溶解。置于酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度，OD值大小與活細(xì)胞成正比，每孔的實際OD值等于實測的OD值減去空白OD值。

1.2.3細(xì)胞上清液中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γGT）、乳酸脫氫酶（LDH）的活性檢測。取對數(shù)生長期的人正常肝細(xì)胞制成懸液，接種至6孔板，每孔2 ml于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到70%～80%，加入不同濃度的LPS，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)立不加樣品的對照組，24 h后取上清液使用試劑盒檢測其中AST、ALT、ALP、γGT和LDH的活性。

1.2.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。取對數(shù)生長期的Chang Liver細(xì)胞制成懸液，接種于有預(yù)處理蓋玻片的6孔板，每孔2 ml于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24 h，制備細(xì)胞爬片，達(dá)到70% ～80%融合時去除培養(yǎng)液，加入不同濃度的LPS，同時設(shè)立不加樣品的對照組，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液后加入4%的多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，再棄去上清加入200 μl/孔的Hoechest 33258染料溶液，在37 ℃培養(yǎng)10～20 min，然后用PBS液（pH 7.4）洗滌細(xì)胞2次，置于熒光顯微鏡下觀察Chang Liver細(xì)胞生長情況及誘導(dǎo)前后形態(tài)學(xué)變化。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用 SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果均以±s表示，組間差異采用oneway ANOVA分析，以P<0.05表示差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度LPS對Chang Liver 細(xì)胞活性的影響在MTT試驗中，由于酶標(biāo)儀測出的實際OD值與活細(xì)胞數(shù)成正比，可以用來反映細(xì)胞損傷情況。從圖1可以看出，LPS作用24 h以后，隨著LPS濃度的增加，OD值逐漸下降，且濃度

注：*表示與陰性對照組差異顯著（P<0.05）。

2.2不同濃度LPS對Chang Liver細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AST、ALT、ALP、γGT、LDH活性的影響由表1可知，不同濃度LPS誘導(dǎo)Chang Liver細(xì)胞后，隨著藥物濃度的增加AST、ALT、ALP、γGT、LDH在細(xì)胞外的濃度均隨著給藥濃度的增加而增加，細(xì)胞損傷程度隨濃度增加而加重。其中，60 μg/ml LPS組培養(yǎng)液中ALP、γGT活性與陰性對照組有顯著差異（P<0.05），80和100 μg/ml組培養(yǎng)液中AST、ALT、ALP、γGT、LDH活性與陰性對照組比較均有顯著性差異（P<0.05）。

2.3不同濃度LPS對Chang Liver細(xì)胞形態(tài)的影響通過MTT和活性試驗可以看出，LPS作用Chang Liver細(xì)胞已出現(xiàn)損傷，再進(jìn)一步的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，可更直觀地看到用LPS誘導(dǎo)后的細(xì)胞變化情況。從圖2可以看出，在200倍熒光顯微鏡下觀察，LPS誘導(dǎo)24 h后對照組細(xì)胞呈均勻的藍(lán)色熒光，細(xì)胞貼壁良好且呈上皮樣舒展。隨著LPS濃度的增加，細(xì)胞損傷變重。當(dāng)LPS濃度為80 μg/ml時，細(xì)胞出現(xiàn)空泡化等細(xì)胞早期凋亡現(xiàn)象。當(dāng)LPS濃度為100 μg/ml時細(xì)胞數(shù)目明顯減少，同時細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、碎裂等細(xì)胞晚期凋亡現(xiàn)象。

3結(jié)論與討論

LPS也稱為內(nèi)毒素，是常見的肝損傷誘導(dǎo)劑。與其他的肝損傷模型（如四氯化碳、D半乳糖胺、乙醇等）相比，LPS尤其是與卡介苗聯(lián)合作用建立的肝損傷動物模型，因其造成的肝炎病變活動（肝細(xì)胞的凋亡、壞死，肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)過分沉積，大量炎細(xì)胞浸潤[9]）類似于人體慢性肝炎病變過程，因此該動物模型更是研究慢性肝病的發(fā)病機(jī)制與篩選保肝藥物的較理想模型之一[10-11]。細(xì)胞凋亡是重癥肝炎特別是病毒性肝炎發(fā)病時的特征性變化，是肝損傷的早期變化之一。研究表明LPS直接作用正常肝細(xì)胞后，肝細(xì)胞受損的原因之一就是LPS誘發(fā)了肝細(xì)胞凋亡[12-13]。因此，LPS是合適的體外肝細(xì)胞損傷模型的誘導(dǎo)劑，但關(guān)于LPS的作用濃度報道較少。

用LPS作用體外穩(wěn)定的肝細(xì)胞系Chang Liver細(xì)胞系，探討LPS作用濃度，建立體外肝細(xì)胞損傷模型，為下一步篩選保肝藥物的成分和濃度及其保肝機(jī)制奠定試驗基礎(chǔ)。經(jīng)LPS作用后，肝細(xì)胞損傷明顯，尤其是80和100 μg/ml LPS濃度作用Chang Liver細(xì)胞時，活細(xì)胞數(shù)目顯著降低（P<0.05）。在正常情況下，肝細(xì)胞的關(guān)鍵性酶AST、ALT位于肝細(xì)胞內(nèi)的線粒體中，其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其在血清中的含量，是肝細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)之一。當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，胞內(nèi)的AST、ALT被大量釋放到細(xì)胞外。此外，肝細(xì)胞內(nèi)還存在大量的ALP、LDH、γGT，當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)液中被大量檢測時，也說明肝細(xì)胞膜通透性改變。在該試驗中用80和100 μg/ml的LPS作用Chang Liver細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)液中的AST、ALT濃度顯著性增加（P<0.05）。隨著LPS濃度的增加，細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALP濃度增高，γGT、LDH被大量釋放到細(xì)胞外，說明Chang Liver細(xì)胞膜通透性改變。同時，觀察到Chang Liver細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生了較大的改變，正常細(xì)胞呈上皮樣舒展、貼壁良好，當(dāng)LPS濃度為80 μg/ml時細(xì)胞出現(xiàn)空泡化等早期凋亡現(xiàn)象。當(dāng)LPS濃度為100 μg/ml時細(xì)胞數(shù)目明顯減少同時細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、碎裂等細(xì)胞晚期凋亡現(xiàn)象。據(jù)此推測，LPS濃度為80 μg/ml是比較合適的誘導(dǎo)劑量。當(dāng)LPS濃度小于80 μg/ml時細(xì)胞活性較好，胞內(nèi)的關(guān)鍵酶也沒有被大量釋放，細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變也較不明顯。當(dāng)LPS濃度為80 μg/ml時雖有損傷，但細(xì)胞膜相對較為完整，細(xì)胞仍具有一定活性，而LPS濃度為100 μg/ml作用Chang Liver細(xì)胞后細(xì)胞已處于凋亡晚期，損傷已不可修復(fù)。注：A.對照組；B、C、D、E、F組為藥物組（LPS濃度分別為20、40、60、80和100 μg/ml）。

圖2不同濃度LPS作用Chang Liver細(xì)胞后的形態(tài)變化 （×200）綜上所述，用濃度80 μg/ml的LPS與Chang Liver細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，可以建立理想的體外肝細(xì)胞損傷模型，為進(jìn)一步研究海洋活性肽對肝細(xì)胞保護(hù)的藥物篩選研究奠定試驗?zāi)Ｐ突A(chǔ)，具有較高的應(yīng)用價值。

參考文獻(xiàn)

[1] RAO J，ELLIOTT M R，LEITINGER N，et al.RahU：An inducible and functionally pleiotropic protein in Pseudomonas aeruginosa modulates innate immunity and inflammation in host cells [J].Cellular Immunology，2011，270：103-113.

[2] YANG S B，LI P F，MI Z X，et al.LPS-induced TNFα factor （LITAF） in the snail Cipangopaludina chinensis：Gene cloning and its apoptotic effect on NCI-H446 cells [J].Fish & Shellfish Immunology，2012，32：268-272.

[3] DHOLAKIYA S L，BENZEROUAL K E.Protective effect of diosmin on LPS-induced apoptosis in PC12 cells and inhibition of TNF-α expression[J].Toxicology in Vitro，2011，25：1039-1044.

[4] LIN M C，PAN C Y，HUI C F，et al.Shrimp anti-lipopolysaccharide factor （SALF），an antimicrobial peptide，inhibits proinflammatory cytokine expressions through the MAPK and NF-κB pathways in LPS-induced HeLa cells [J].Peptides，2013，40：42-48.

[5] PHILIP MEULEMAN，LOUIS LIBBRECHT，STEFAN WIELAND，et al.Immune Suppression Uncovers Endogenous Cytopathic Effects of the Hepatitis B Virus [J].Journal of Virology，2006，80：2797-2807.

[6] PAOLA LORIA，AMEDEO LONARDO，NICOLA CARULLI.Relative Contribution of Iron Burden，HFE Mutations，and Insulin Resistance to Fibrosis in Nonalcoholic Fatty Liver[J].Hepatology，2004，39：179-187.

[7] DEBOLINA NANDI，MANOJ KUMAR MISHRA，ANIRBAN BASU，et al.Protective effects of interleukin-6 in lipopolysaccharide（LPS）-induced experimental endotoxemia are linked to alteration in hepatic anti-oxidant enzymes and endogenous cytokines[J].Immunobiology，2010，215：443-451.

[8] 劉小偉，游宇，盧放根，等.LPS 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子TLR4 表達(dá)與小鼠肝損傷的關(guān)系[J].湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2003，28（3）：217-220.

[9] 王泰齡，王寶恩，劉霞，等.慢性病毒性肝炎纖維化分期與血清學(xué)指標(biāo)的關(guān)系[J].中華病理學(xué)雜志，1998，27（3）：185-190.